Decreto-LeiEm vigor

Decreto-Lei n.º 248/2007

Artigo 1.º

Transposição de directivas

O presente decreto-lei transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva n.º 2006/56/CE, da Comissão, de 12 de Junho, que altera os anexos da Directiva n.º 93/85/CE, do Conselho, de 4 de Outubro, relativa à luta contra a podridão anelar da batateira, procedendo, simultaneamente, à consolidação legislativa da transposição de ambas as directivas.

Artigo 2.º

Objecto

1 -O presente decreto-lei estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckerman et Kottoff) Davis et al., causadora da podridão anelar da batateira, a seguir designada por organismo prejudicial, no sentido de evitar o seu aparecimento e, uma vez detectada, localizá-la e determinar a sua distribuição, evitar a sua dispersão e combatê-la com vista à sua eventual erradicação.

2 -O disposto no presente decreto-lei é aplicável, sem prejuízo do disposto no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, na redacção que lhe foi dada pelo Decreto-Lei n.º 193/2006, de 26 de Setembro, que actualiza o regime fitossanitário que cria e define as medidas de protecção fitossanitária destinadas a evitar a introdução e dispersão no território nacional e comunitário, incluindo nas zonas protegidas, de organismos prejudiciais aos vegetais e produtos vegetais, qualquer que seja a sua origem ou proveniência. CAPÍTULO II Controlo do organismo prejudicial

Artigo 3.º

Prospecção oficial

1 -Para efeitos do disposto no n.º 1 do artigo anterior, a Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural (DGADR) define, elabora e coordena a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, cuja execução se realiza anualmente.

2 -A execução do programa de prospecção referido no número anterior cabe aos serviços de inspecção fitossanitária das direcções regionais de agricultura e pescas (DRAP) e dos correspondentes organismos das Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira, nas respectivas áreas de actuação.

3 -As prospecções previstas no programa nacional incidem obrigatoriamente sobre tubérculos e, sempre que apropriado, em plantas de batateira de Solanum tuberosum L., sendo que:

a)Quando se tratar de tubérculos, são colhidas amostras tanto de batata-semente como de outras batatas, de preferência provenientes de lotes em armazém, que são submetidas a testes laboratoriais oficiais ou realizados sob controlo oficial, utilizando o método para a detecção e diagnóstico do organismo prejudicial referido no número seguinte, podendo, se adequado, ser efectuada uma inspecção visual oficial ou oficialmente controlada, através de corte de tubérculos noutras amostras;

b)Quando se tratar de plantas, estas prospecções são efectuadas segundo métodos adequados e as amostras são submetidas a testes laboratoriais de acordo com o disposto no número seguinte.

4 -O método de diagnóstico, detecção e identificação do organismo prejudicial nos tubérculos é o referido no anexo I do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, devendo ser utilizado para as plantas de batateira qualquer outro método adequado oficial ou oficialmente controlado.

5 -A DGADR deve comunicar anualmente à Comissão Europeia e aos demais Estados membros os resultados da execução do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial.

Artigo 4.º

Dever de informação em relação ao organismo prejudicial

Qualquer pessoa que saiba ou suspeite da presença do organismo prejudicial em plantas de batateira e ou em tubérculos colhidos, armazenados ou comercializados no território nacional deve informar de imediato os serviços de inspecção fitossanitária das DRAP ou a DGADR.

Artigo 5.º

Procedimentos no caso de suspeita da presença do organismo prejudicial

1 -Considera-se estar perante uma ocorrência suspeita quando a confirmação da presença do organismo prejudicial se tenha verificado por meio de:

a)Observação de sintomas visuais de diagnóstico suspeito da doença; ou

b)Obtenção de um resultado positivo num teste de imunofluorescência, através de uma leitura positiva num teste de rastreio confirmada por um resultado positivo num segundo teste de rastreio apropriado (PCR/FISH), tal como consta do anexo I.

2 -Em caso de ocorrência suspeita, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente devem:

a)Assegurar a realização de testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados, conforme previsto no n.º 4 do artigo 3.º, de acordo com as condições definidas no n.º 1 do anexo II do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a fim de confirmar ou refutar a ocorrência suspeita;

b)Proibir a utilização e a circulação de todos os lotes ou remessas dos quais tenham sido colhidas amostras, excepto sob o seu controlo e desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial;

c)Adoptar medidas adicionais a fim de determinar a origem da ocorrência suspeita e evitar a dispersão do organismo prejudicial.

Artigo 6.º

Procedimentos no caso de confirmação da presença do organismo prejudicial

1 -Sempre que a presença do organismo prejudicial seja confirmada através dos testes laboratoriais referidos no n.º 4 do artigo 3.º, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente devem:

a)Zelar pelo cumprimento dos procedimentos estabelecidos no n.º 2 do anexo II;

b)Declarar contaminados os tubérculos e ou plantas de batateira, as remessas e ou lotes, a maquinaria, os veículos, os navios, os armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, em que tiver sido colhida a amostra, e, quando adequado, o local ou locais de produção e os campos onde tiverem sido colhidos os tubérculos ou as plantas de batateira;

c)Determinar, na sequência da declaração de contaminação dos tubérculos ou plantas de batateira, a realização de testes laboratoriais de acordo com o disposto no n.º 4 do artigo 3.º nos lotes de batata com uma relação clonal com a batata infectada, sendo que os testes são realizados no número de tubérculos ou plantas necessário para determinar a provável fonte primária de infecção e a extensão da contaminação provável, de preferência por ordem do grau de risco;

d)Determinar, tendo em conta o disposto no n.º 1 do anexo III do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a extensão da contaminação provável por contacto pré ou pós-colheita ou por relação de produção com a contaminação declarada;

e)Demarcar uma zona, com base na declaração de contaminação, na determinação da extensão da contaminação provável e na possível dispersão do organismo prejudicial, tendo em conta o disposto no n.º 2 do anexo III.

2 -A DGADR deve comunicar à Comissão Europeia e aos outros Estados membros qualquer contaminação declarada e os pormenores respeitantes à demarcação da zona.

3 -A comunicação referida no número anterior deve ser efectuada nos termos do disposto no n.º 3 do anexo III.

Artigo 7.º

Medidas de protecção fitossanitária subsequentes

1 -Os tubérculos e ou as plantas de batateira declarados contaminados não podem ser plantados e, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente são:

a)Destruídos;

b)Eliminados de outro modo, de acordo com medidas oficialmente controladas, nos termos do n.º 1 do anexo IV e do anexo V do presente decreto-lei, do qual fazem parte integrante, desde que se tenha concluído não existir qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial.

2 -Os tubérculos e ou as plantas de batateira considerados provavelmente contaminados não podem ser plantados e, sem prejuízo do resultados dos testes referidos na alínea c) do n.º 1 do artigo anterior, para os lotes de batata com relação clonal, são, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, alvo de utilização ou eliminação adequados, nos termos especificados no n.º 2 do anexo IV, e em condições que garantam a inexistência de qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial.

3 -Toda a maquinaria, os veículos, os navios, os armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo o material de embalagem, declarados contaminados ou considerados provavelmente contaminados são destruídos ou limpos e desinfectados segundo métodos adequados, como especificado no n.º 3 do anexo IV, sendo que após a desinfecção esses objectos deixam de ser considerados contaminados.

4 -Sem prejuízo das medidas aplicadas nos termos dos números anteriores, na zona demarcada são, também, aplicadas as medidas especificadas no n.º 4 do anexo IV.

5 -Só é permitida a plantação de batata-semente desde que:

a)Sejam satisfeitas as exigências estabelecidas no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro;

b)A batata seja proveniente, em linha directa, de material obtido no âmbito de um programa oficialmente aprovado que tenha sido declarado isento do organismo prejudicial em testes oficiais ou controlados oficialmente, utilizando o método previsto no n.º 4 do artigo 3.º

6 -Os testes referidos na alínea b) do número anterior devem ser realizados:

a)Quando a contaminação afectar a produção de batata-semente nas plantas da selecção clonal inicial;

b)Nos restantes casos, tanto nas plantas da selecção clonal inicial como em amostras representativas de batata-semente de base ou de material de multiplicação anterior.

Artigo 8.º

Notificação das medidas fitossanitárias

As medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar são objecto de notificações oficiais emanadas das DRAP, dirigidas às pessoas singulares e colectivas envolvidas.

Artigo 9.º

Encargos dos operadores económicos

Os encargos resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária referidas no número anterior são suportados pelos respectivos operadores económicos.

Artigo 10.º

Proibição

É proibida a posse e manuseamento do organismo prejudicial.

Artigo 11.º

Derrogações

Para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção varietal, a DGADR pode autorizar a não execução do disposto na alínea c) do n.º 1 do artigo 6.º, nos n.os 1 a 4 do artigo 7.º e no artigo 10.º, para efeitos de aplicação do Decreto-Lei n.º 91/98, de 14 de Abril, que estabelece as condições pelas quais determinados organismos prejudiciais, vegetais, produtos vegetais e outros materiais podem ser introduzidos ou circular na Comunidade ou em zonas protegidas para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção de variedades.

CAPÍTULO III

Regime contra-ordenacional

Artigo 12.º

Contra-ordenações

1 -As seguintes infracções constituem contra-ordenações puníveis com coima cujo montante mínimo é de (euro) 100 e máximo de (euro) 3740 ou mínimo de (euro) 250 e máximo de (euro) 44890, consoante o agente seja pessoa singular ou colectiva:

a)A omissão do dever de informação previsto no artigo 4.º;

b)O não cumprimento das medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar ao abrigo do artigo 8.º e em violação do disposto nos artigos 5.º e 7.º;

c)O não cumprimento dos encargos financeiros resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária a aplicar ao abrigo do artigo 8.º, em violação do disposto no artigo 9.º;

d)A posse e o manuseamento do organismo prejudicial, em violação do disposto no artigo 10.º

2 -A tentativa e a negligência são puníveis, sendo nesse caso reduzidos para metade os limites mínimos e máximos referidos no número anterior.

Artigo 13.º

Sanções acessórias

1 -Em função da gravidade da infracção e da culpa do agente, podem ser aplicadas, simultaneamente com as coimas, as seguintes sanções acessórias:

a)Perda de objectos pertencentes ao agente;

b)Interdição do exercício de profissões ou actividades cujo exercício dependa de título público ou de autorização ou de homologação de autoridade pública;

c)Privação do direito a subsídio ou benefício outorgado por entidades ou serviços públicos;

d)Privação do direito de participar em feiras ou mercados;

e)Encerramento de estabelecimento cujo funcionamento esteja sujeito a autorização de autoridade administrativa;

f)Suspensão de autorizações.

2 -As sanções previstas no número anterior têm a duração máxima de um ano.

3 -No caso de uma conduta contra-ordenacional ter ocasionado um grave risco de propagação do organismo prejudicial, deve ser dada publicidade à decisão condenatória definitiva de aplicação da coima, mediante a afixação de editais na sede da DRA da área onde foi praticada a infracção.

Artigo 14.º

Processos de contra-ordenação

Sem prejuízo das competências atribuídas por lei às autoridades policiais e fiscalizadoras, o levantamento dos autos e a instrução dos processos de contra-ordenação são da competência da DRAP da região em cuja área foi praticada a contra-ordenação, competindo ao director-geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a aplicação das coimas e sanções acessórias.

Artigo 15.º

Produto das coimas

a)Em 10% para a entidade que levantou o auto de contra-ordenação;

b)Em 10% para a entidade que instruiu o processo;

c)Em 20% para a entidade que aplicou a coima;

d)Em 60% para o Estado. CAPÍTULO IV Disposições finais

Artigo 16.º

Aplicação às Regiões Autónomas

1 -Sem prejuízo das competências atribuídas à DGADR na qualidade de autoridade fitossanitária nacional, as competências atribuídas pelo presente decreto-lei às DRAP são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos dos departamentos regionais competentes.

2 -As competências previstas no artigo 14.º são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos definidos pelos órgãos de governo próprio.

3 -As percentagens previstas no artigo 15.º provenientes das coimas aplicadas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira constituem receita própria de cada uma delas.

Artigo 17.º

Norma revogatória

É revogada a Portaria n.º 140/95, de 9 de Fevereiro.

Artigo 18.º

Remissão

1 -- Apresentação do Fluxograma:

a)Aquecidos a uma temperatura mínima de 60°C atingida em todo o volume durante, pelo menos, 30 minutos antes da eliminação; ou

b)Eliminados através de outro método sujeito a aprovação e controlo oficial, por forma a que não exista nenhum risco identificável de que os resíduos possam entrar em contacto com as terras agrícolas, devendo os respectivos pormenores ser comunicados aos restantes Estados membros e à Comissão Europeia.

i)3 minutos a uma temperatura de 95°C (desnaturação do ADN- alvo). 10 ciclos de:

ii)1 minuto a uma temperatura de 95°C (desnaturação do ADN-alvo);

iii)1 minuto a uma temperatura de 64°C (emparelhamento dos iniciadores);

iv)1 minuto a uma temperatura de 72°C (extensão da cópia). 25 ciclos de:

v)30 segundos a uma temperatura de 95°C (desnaturação do ADN-alvo);

vi)30 segundos a uma temperatura de 62°C (emparelhamento dos iniciadores);

vii)1 minuto a uma temperatura de 72°C (extensão da cópia); 1 ciclo de:

viii)5 minutos a uma temperatura de 72°C (extensão final);

ix)Manter a uma temperatura de 4°C. Nota. - Este programa está optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii),iii), iv), v), vi) e vii).

2 -Observação visual dos sintomas de podridão anelar:

i)Aquecer 9 ml de água de grau molecular [por exemplo, água ultra pura (UPW)] a cerca de 60°C e adicionar 0,4 g de paraformaldeído. O paraformaldeído dissolve-se após a adição de 5 gotas de NaOH 1N e a agitação num agitador magnético;

ii)Ajustar o pH a 7,0 mediante adição de 1 ml de tampão fosfato 0,1M (PB; pH 7,0) e 5 gotas de HCl 1N. Verificar o pH com papel indicador e ajustar, se necessário, com HCl ou NaOH. Nota. - Atenção! Não utilizar um medidor de pH em soluções contendo paraformaldeído.

iii)Filtrar a solução através de um filtro de membrana de 0,22(mi)m e manter ao abrigo da poeira a 4°C até à sua utilização.

iv)Nota: Solução fixadora alternativa: etanol a 96%.

3 -Preparação da amostra:

a)Cobrir os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 3) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24ºC ou durante 16-24 horas refrigerados; ou

b)Homogeneizar os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 3) num misturador (por exemplo, Waring Blender ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco de maceração descartável selado (por exemplo, Stomacher ou Bioreba em polietileno resistente, de 150 mm x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). Nota. - O risco de contaminação cruzada das amostras é elevado quando estas são homogeneizadas com recurso a um misturador. Tomar as precauções necessárias para evitar a formação de aerossóis ou derrames durante o processo de extracção. Assegurar-se de que as lâminas e os recipientes do misturador utilizados para cada amostra foram recentemente esterilizados. Caso se utilize o teste PCR, evitar a contaminação por ADN dos recipientes ou instrumento de trituração. Sempre que se utilize o teste PCR, recomenda-se a trituração em sacos descartáveis e a utilização de tubos descartáveis.

4 -Teste IF: Princípio: A utilização do teste IF como teste de rastreio principal é recomendada, tendo em conta a sua robustez comprovada para alcançar os limiares de detecção exigidos. Sempre que se utilize o teste IF como teste de rastreio principal e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste PCR ou o teste FISH como segundo teste de rastreio. Sempre que se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo como fluxograma para completar a análise. Nota. - Utilizar sempre um anticorpo policlonal quando o teste IF for usado como principal teste de rastreio. No caso de se obter um resultado positivo no teste IF com um anticorpo policlonal, as amostras podem ser submetidas a novos testes com um anticorpo monoclonal que, embora apresente uma maior especificidade, pode ser menos sensível. Utilizar anticorpos contra uma estirpe de referência de C. m. subsp. sepedonicus. Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml da estirpe homóloga de C. m. subsp. sepedonicus, e recorrendo a um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), de acordo com as recomendações do fabricante. Os anticorpos policlonais ou monoclonais nativos devem possuir um título IF de, pelo menos, 1:2000. Durante o teste, os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho (DT) próximas do título ou no seu valor exacto. Utilizar anticorpos validados (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). O teste deve ser realizado com extractos de amostras recentemente preparados. Se necessário, pode ser executado com sucesso em extractos armazenados entre -68 e -86°C e conservados em glicerol. O glicerol pode ser retirado da amostra através da adição de 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4), nova centrifugação durante 15 minutos a 7000 g e ressuspensão num volume igual de tampão de ressuspensão. Este procedimento é frequentemente desnecessário, em especial se as lâminas forem fixadas à chama (ver n.º 2.2). Preparar lâminas de controlo positivo em separado com uma estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de C. m. subsp. sepedonicus suspensa em extracto de batata, tal como especificado no apêndice n.º 2 e, opcionalmente, em tampão. Sempre que possível, deve também ser utilizado material vegetal naturalmente infectado (liofilizado ou congelado a uma temperatura compreendida entre 16 e 24°C) como controlo positivo na mesma lâmina. Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que anteriormente se tenham revelado negativas relativamente à presença de C. m. subsp. sepedonicus. Utilizar lâminas de microscópio com vários poços, de preferência 10, com, pelo menos, 6 mm de diâmetro cada. Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

a)Durante, pelo menos, os três anos de cultura seguintes ao da declaração de contaminação:

b)Durante os quatro anos de cultura seguintes ao da declaração de contaminação:

c)Pelo menos durante o terceiro ano de cultivo após a declaração de contaminação, só são plantadas, para obtenção de semente ou de batata para consumo, batatas de semente certificadas ou cultivadas sob controlo oficial, a partir de batatas de semente certificadas;

d)Em cada um dos anos de cultivo referidos nas alíneas anteriores, são tomadas medidas para eliminar batateiras espontâneas e outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial, caso surjam, e são efectuados testes oficiais às batatas colhidas em cada campo, em conformidade com o procedimento constante do anexo I;

i)Para sedimentos com relativamente pouco amido: Pipetar um volume-padrão (15(mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma diluição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume semelhante de sedimento não diluído (1/1) nos restantes poços da fila. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 1.

ii)Para outros sedimentos: Preparar diluições decimais (1/10 e 1/100) do sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume-padrão (15(mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) do sedimento ressuspenso e de cada uma das diluições numa fila de poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 2.

iii)Exigem que os lotes de batata de semente e de batata de consumo colhidos na zona sejam manuseadas separadamente ou um sistema de limpeza e desinfecção entre o manuseamento de lotes para semente e para consumo;

iv)Realizam uma prospecção oficial nos termos do artigo 3.º;

5 -Teste FISH: Princípio: Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste FISH como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com fluxograma para completar o diagnóstico. Nota. - Utilizar sondas validadas específicas para C. m. subsp. sepedonicus (apêndice n.º 7). O teste preliminar com este método deve permitir a detecção reprodutível de, pelo menos, 10(elevado a 3)-10(elevado a 4) células de C. m. subsp. sepedonicus por ml adicionadas a extractos de amostras que anteriormente se tenham revelado negativos. O procedimento seguinte deverá ser realizado, de preferência, com um extracto de amostra preparado na altura da utilização, mas pode também ser realizado com sucesso com um extracto de amostra que tenha sido armazenado em glicerol a uma temperatura compreendida entre 16 e 24°C ou 68 e 86°C. Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para C. m. subsp sepedonicus. Como controlos positivos preparar suspensões contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células de C. m. subsp. sepedonicus por ml provenientes de uma cultura com 3 a 5 dias (por exemplo, estirpe NCPPB 4053 ou PD 406) em tampão fosfato (PB) 0,01M (para a preparação ver apêndice n.º 2). Preparar lâminas de controlo positivo em separado com a estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de C. m. subsp. sepedonicus suspensa em extracto de batata, tal como especificado no apêndice n.º 2. A utilização de sondas para eubactérias marcadas com FITC oferece um controlo para o processo de hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na amostra ficarão coradas. Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

i)Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH quando se observarem, com um filtro para FITC, células brilhantes com fluorescência verde de dimensões e morfologia típicas de C. m. subsp. sepedonicus e, com o filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha em todos os controlos positivos, as quais deverão estar ausentes em todos os controlos negativos. Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 4). As amostras com, pelo menos, 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas como potencialmente contaminadas. A realização de outros testes é obrigatória. As amostras com menos de 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas negativas;

ii)O teste FISH é negativo se não se observarem, com um filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típicas de C. m. subsp. sepedonicus, mas sejam observadas células típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas preparações de controlo positivo mediante a utilização do filtro para rodamina.

6 -PCR: Princípios: Sempre que se utilize a PCR como teste de rastreio principal e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste PCR como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico. A exploração completa deste método como teste de rastreio principal é apenas recomendada quando tenham sido adquiridos conhecimentos altamente especializados. Nota. - Os testes preliminares com este método deveriam permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de C. m. subsp. sepedonicus por ml adicionadas a amostras de extractos que apresentaram anteriormente resultados negativos. Poderão ser necessárias experiências de optimização para alcançar os níveis máximos de sensibilidade e especificidade em todos os laboratórios. Utilizar reagentes e protocolos PCR validados. Seleccionar, de preferência, um método que disponha de um controlo interno. Tomar as precauções necessárias para evitar a contaminação da amostra com ADN-alvo. O teste PCR deverá ser realizado por técnicos experimentados, em laboratórios dedicados à biologia molecular, no sentido de minimizar a possibilidade de contaminação com ADN-alvo. Os controlos negativos (para os procedimentos de extracção de ADN e PCR) devem ser sempre manipulados como amostras finais no procedimento, a fim de evidenciar a ocorrência de qualquer contaminação com ADN. Devem ser incluídos no teste PCR os seguintes controlos negativos: Extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado e se tenha revelado negativo relativamente à presença de C. m. subsp. sepedonicus; Controlos dos tampões utilizados para extrair a bactéria e o ADN da amostra; Mistura de reacção da PCR. Devem ser incluídos os seguintes controlos positivos: Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se adicionou C. m. subsp. sepedonicus (ver preparação no apêndice n.º 2); Uma suspensão em água contendo 10(elevado a 6) células por ml de um isolado virulento (por exemplo, NCPPB 2140 ou NCPPB 4053) de C. m. subsp. sepedonicus; Se possível, utilizar também ADN extraído de amostras de controlo positivas no teste PCR. Nota. - Para evitar uma potencial contaminação, os controlos positivos devem ser preparados num ambiente separado do das amostras a serem testadas. Os extractos de amostras devem estar, o mais possível, isentas de terra. Seria, por isso, em alguns casos, mais prudente preparar as extracções a partir de batatas lavadas, caso se utilizem os testes PCR..

7 -Bioensaio: Nota. - Um teste preliminar com este método deve permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) unidades formadoras de colónias de C. m. subsp. sepedonicus por ml adicionadas a amostras de extractos para os quais se obtiveram anteriormente resultados negativos (para a preparação ver apêndice n.º 2). A mais elevada sensibilidade de detecção pode ser esperada quando se utiliza uma amostra de extracto recentemente preparada e condições de crescimento óptimas. No entanto, o método pode ser aplicado com sucesso a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre 68 e 86°C. Algumas variedades de beringelas constituem um excelente meio de enriquecimento selectivo para o crescimento de C. m. subsp. sepedonicus, mesmo na ausência de sintomas, proporcionando também um excelente teste de patogenicidade para confirmação da identificação da bactéria. As condições de cultivo devem ser óptimas para reduzir o risco de falsos resultados negativos. Para os pormenores das condições de cultivo, ver apêndice n.º 8.

8 -Isolamento de C. m. subsp. sepedonicus: Nota. - O diagnóstico apenas está completo se se isolar C. m. subsp. sepedonicus, se esta bactéria for subsequentemente identificada (ver n.º 9) e confirmada a sua identificação por um teste de patogenicidade (n.º 10). Embora C. m. subsp. sepedonicus seja um organismo difícil de cultivar, pode ser isolado a partir de tecidos sintomáticos. No entanto, como as bactérias saprófitas podem crescer mais rapidamente, é difícil isolar o patogéneo directamente a partir dos sedimentos ressuspensos dos tecidos dos tubérculos ou plantas de batateira (n.º 3.1.6 ou n.º 3.2.5). O isolamento directo de C. m. subsp. sepedonicus pode, contudo, ser possível com um meio selectivo e uma diluição adequada do sedimento ressuspenso dos hilos ou dos caules de batateiras. Devem ser efectuados isolamentos de todos os tubérculos ou segmentos de caule de batateira que apresentem sintomas típicos, bem como de beringelas inoculadas que, muito embora possam não ter manifestado sintomas, se revelem positivas no teste IF/PCR realizado sobre amostras compostas (ver n.º 7.10). A maceração dos caules de beringela, quando necessária, deve ser efectuada tal como descrito no n.º 3.2.2. Como controlos positivos, preparar diluições decimais de uma suspensão de 10(elevado a 6) ufc por ml de C. m. subsp. sepedonicus (por exemplo, NCPPB 4053 ou PD 406). Para evitar qualquer possibilidade de contaminação, os controlos positivos devem ser preparados totalmente à parte das amostras a testar. A boa qualidade de cada novo lote de meio selectivo para o crescimento do patogéneo deve ser testada antes da sua utilização para análise de amostras de rotina. Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

9 -Identificação: Identificar culturas puras de presumíveis isolados de C. m. subsp. sepedonicus, utilizando, pelo menos, dois dos seguintes testes baseados em princípios biológicos diferentes. Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado.

a)Preparar uma suspensão com cerca de 10(elevado a 6) células por ml em tampão IF (apêndice n.º 3);

b)Preparar uma série de diluições a 1/2 de um anti-soro adequado;

c)Aplicar o procedimento de IF (n.º 4);

d)Um resultado positivo no teste IF é alcançado se o título IF da cultura for equivalente ao do controlo positivo.

10 -Teste de confirmação: O teste de patogenicidade tem de ser efectuado como confirmação final do diagnóstico de C. m. subsp. sepedonicus e para avaliar a virulência dos isolados identificados como C. m. subsp. sepedonicus:

11 -Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-118.

12 -Lelliott, R. A., E. Billing e A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.

13 -Lelliott, R. A. e P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bol. 6 (2), 101-106.

14 -Li, X. e S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837-842.

15 -Mills, D., Russell, B., W. e J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensisssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phyto-pathology, 87, 8, 853-861.

16 -Pastrik, K. -H. e R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687-693.

17 -Pastrik, K. - H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

18 -Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

19 -Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. e Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095-1100.

20 -Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp.

21 -Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.

22 -Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739-748.

23 -Sneath, P. H. A. e V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527.

24 -Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

25 -Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. e A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546-4554. ANEXO II Ocorrência suspeita e confirmação da presença do organismo prejudicial

i)No diagnóstico da podridão anelar em tubérculos e plantas de batateira;

ii)Na detecção de C. m. subsp. sepedonicus em amostras de tubérculos e plantas de batateira;

iii)Na identificação de C. m. subsp. sepedonicus. Princípios gerais: Nos apêndices são apresentados os protocolos optimizados para os diversos métodos, reagentes validados e pormenores relativos à preparação dos materiais para realização dos testes e para os controlos. O apêndice n.º 1 apresenta uma lista dos laboratórios que foram incluídos na optimização e validação dos protocolos. Visto que os protocolos envolvem a detecção de um organismo de quarentena e incluem a utilização de culturas viáveis de C. m. subsp. sepedonicus como materiais de controlo, é necessário executar os procedimentos sob condições de quarentena adequadas, em instalações com sistemas apropriados de eliminação de resíduos e possuindo as licenças adequadas emitidas pelas autoridades oficiais competentes em matéria de quarentena fitossanitária. Os parâmetros dos ensaios devem assegurar níveis de detecção de C. m. subsp. sepedonicus consistentes e reprodutíveis nos limiares definidos para os métodos seleccionados. É primordial a preparação rigorosa dos controlos positivos. A realização dos ensaios de acordo com os limiares exigidos implica também uma correcta regulação, manutenção e calibração do equipamento, manuseamento e preservação cuidadosos dos reagentes e estabelecimento de todas as medidas destinadas a evitar a contaminação entre amostras, por exemplo, a separação dos controlos positivos das amostras a testar. Devem ser aplicadas normas de controlo de qualidade no sentido de evitar erros administrativos e outros, em especial relativamente à rotulagem e documentação. Uma ocorrência suspeita, tal como referido no n.º 1 do artigo 5.º, implica um resultado positivo nos testes de diagnóstico ou de rastreio numa amostra, tal como especificado nos fluxogramas. Caso o primeiro teste de rastreio (IF ou PCR/FISH) seja positivo, suspeita-se, então, de contaminação por C. m. subsp. sepedonicus e deve efectuar-se um segundo teste de rastreio. Se o segundo teste de rastreio for positivo, confirma-se, então, a suspeita (ocorrência suspeita) e devem continuar-se os testes de acordo com o esquema. Caso o segundo teste de rastreio seja negativo, a amostra é, então, considerada não contaminada por C. m. subsp. sepedonicus. Por isso, tal como referido na alínea b) do n.º 1 do artigo 5.º, um teste IF positivo é definido por uma leitura IF positiva confirmada por um segundo teste de rastreio (PCR/FISH). A presença confirmada, tal como referido no n.º 1 do artigo 6.º, implica o isolamento e identificação de uma cultura pura de C. m. subsp. sepedonicus com confirmação de patogenicidade.