Decreto-LeiEm vigor

Decreto-Lei n.º 249/2007

Artigo 1.º

Transposição de directivas

O presente decreto-lei transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva n.º 2006/63/CE, da Comissão, de 14 de Julho, que altera os anexos II a VII da Directiva n.º 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho, relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., procedendo, simultaneamente, à consolidação legislativa da transposição de ambas as directivas.

Artigo 2.º

Objecto

1 -O presente decreto-lei estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., causadora da doença do pus ou mal murcho da batateira e do mal murcho tomateiro, a seguir designada por organismo prejudicial, no sentido de evitar o seu aparecimento, e, uma vez detectada, localizá-la e determinar a sua distribuição, evitar a sua dispersão e combatê-la com vista à sua eventual erradicação.

2 -O disposto no presente decreto-lei é aplicável, sem prejuízo do disposto no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, que actualiza o regime fitossanitário que cria e define as medidas de protecção fitossanitária destinadas a evitar a introdução e dispersão no território nacional e comunitário, incluindo nas zonas protegidas, de organismos prejudiciais aos vegetais e produtos vegetais qualquer que seja a sua origem ou proveniência. CAPÍTULO II Controlo do organismo prejudicial

Artigo 3.º

Prospecção oficial

1 -Para efeitos do disposto no número anterior, a Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural (DGADR) define, elabora e coordena a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, cuja execução se realiza anualmente.

2 -A execução do programa de prospecção referido no número anterior cabe aos serviços de inspecção fitossanitária das direcções regionais de agricultura e pescas (DRAP) e dos correspondentes organismos das Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira, nas respectivas áreas de actuação.

3 -As prospecções previstas no programa nacional são realizadas em conformidade com o disposto no n.º 1 da secção II do anexo I do presente decreto-lei, que dele faz parte integrante, e incidem obrigatoriamente sobre as plantas constantes da lista a que se refere a secção I do anexo I, a seguir designadas por materiais vegetais.

4 -De acordo com a avaliação do risco de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.º 1, as prospecções podem ser realizadas, utilizando métodos adequados, em zonas de produção de batata, tomate e outras solanáceas e em viveiros de tomateiro, assim como em locais de transformação industrial e centros de embalagem.

5 -Igualmente de acordo com a avaliação do risco de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.º 1, as prospecções podem ainda incidir sobre outras plantas solanáceas, para além dos materiais vegetais, e infestantes da mesma família, águas superficiais utilizadas para rega dos materiais vegetais, resíduos líquidos de descarga e resíduos sólidos provenientes de instalações de transformação industrial de batata e tomate ou de embalagem de batata, meios de cultura e solo, a seguir designados por outros materiais, recorrendo a métodos adequados, e, quando necessário, com colheita de amostras que são submetidas a testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados.

6 -O método de diagnóstico, detecção e identificação do organismo prejudicial nos materiais vegetais é o referido no anexo II do presente decreto-lei, que dele faz parte integrante, devendo ser utilizado, nos outros materiais, qualquer outro método adequado oficialmente aprovado.

7 -A DGADR deve comunicar anualmente à Comissão Europeia e aos demais Estados membros os resultados da execução do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, em conformidade com o disposto no n.º 2 da secção II do anexo I.

Artigo 4.º

Dever de informação em relação ao organismo prejudicial

Qualquer pessoa que saiba ou suspeite da presença do organismo prejudicial em qualquer dos materiais vegetais ou nos outros materiais deve informar de imediato os serviços de inspecção fitossanitária das DRAP ou a DGADR.

Artigo 5.º

Procedimentos no caso de suspeita da presença

1 -Considera-se estar perante uma ocorrência suspeita quando a confirmação da presença do organismo prejudicial se tenha verificado por meio de:

a)Observação de sintomas de diagnóstico da doença causada pelo organismo prejudicial e se obteve um resultado positivo no ou nos testes rápidos de rastreio, definidos no n.º 1 da secção I e na secção II do anexo II; ou

b)Obtenção de um resultado positivo no ou nos testes de rastreio definidos no n.º 2 da secção I e na secção III do anexo II.

2 -Em caso de ocorrência suspeita, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente devem:

a)Assegurar a realização de testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados, conforme previsto no n.º 6 do artigo 3.º, de acordo com as condições definidas no n.º 1 do anexo III do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a fim de confirmar ou refutar a ocorrência suspeita;

b)Proibir a utilização e a circulação de plantas ou tubérculos de todas as colheitas, lotes ou remessas em que tenham sido colhidas amostras, excepto sob o seu controlo e desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial;

c)Adoptar medidas adicionais a fim de determinar a origem da ocorrência suspeita e evitar a dispersão do organismo prejudicial.

3 -Nos casos de ocorrência suspeita relativamente à qual existam riscos de contaminação dos materiais vegetais ou das águas superficiais de ou para outro Estado membro, a DGADR deve comunicar imediatamente, de acordo com o risco identificado, os organismos responsáveis dos Estados membros em causa, bem como a Comissão Europeia, dos dados relativos à citada ocorrência suspeita.

Artigo 6.º

Procedimentos no caso de confirmação da presença

1 -Sempre que a presença do organismo prejudicial seja confirmada através dos testes laboratoriais referidos no n.º 6 do artigo 3.º, os serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente devem:

a)Zelar pelo cumprimento dos procedimentos estabelecidos no n.º 2 do anexo III;

b)No que respeita aos materiais vegetais:

c)Para as culturas de plantas hospedeiras diferentes das referidas na alínea anterior, quando considerarem que está em risco a produção dos materiais vegetais:

d)Para as águas superficiais, incluindo resíduos líquidos de descarga de instalações de transformação industrial ou de embalagem que lidem com os materiais vegetais, e para solanáceas silvestres hospedeiras, quando considerarem que está em risco a produção dos materiais vegetais, por via da irrigação, aspersão ou inundação por águas superficiais:

2 -A DGADR deve comunicar à Comissão Europeia e aos restantes Estados membros qualquer contaminação declarada:

a)Nos termos das subalíneas ii) da alínea b) e ii) da alínea d) do número anterior;

b)Dos pormenores respeitantes à demarcação da zona nos termos da subalínea iv) da alínea b) do número anterior;

c)Quando aplicável, dos pormenores respeitantes à demarcação da zona nos termos da subalínea iii) da alínea d) do número anterior, nos termos do disposto no n.º 3 do anexo V.

3 -A comunicação referida no número anterior é acompanhada da comunicação adicional prevista no n.º 4 do anexo V.

Artigo 7.º

Medidas de protecção fitossanitária subsequentes

1 -Os materiais vegetais declarados contaminados não podem ser plantados e sob controlo e aprovação dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente são sujeitos a um dos processos indicados no n.º 1 do anexo VI e do anexo VII do presente decreto-lei, do qual fazem parte integrante, em condições que garantam que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial.

2 -Os materiais vegetais declarados como provavelmente contaminados, incluindo os materiais vegetais que tenham sido considerados em risco, produzidos em locais de cultura declaradas como provavelmente contaminadas, não podem ser plantados e, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, são utilizados de forma adequada ou eliminados conforme especificado no n.º 2 do anexo VI, em condições que garantam que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial.

3 -Toda a maquinaria, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo o material de embalagem declarados contaminados, ou considerados como provavelmente contaminados, são destruídos ou descontaminados segundo métodos adequados conforme especificado no n.º 3 do anexo VI, sendo após a descontaminação esses objectos deixam de ser considerados contaminados.

4 -Sem prejuízo das medidas aplicadas nos termos dos números anteriores, na zona demarcada, são, também, aplicadas as medidas especificadas nos n.os 4.1 e 4.2 do anexo VI.

5 -Só é permitida a plantação de batata-semente desde que:

a)Sejam satisfeitas as exigências estabelecidas no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro;

b)A batata seja proveniente, em linha directa, de material obtido no âmbito de um programa oficialmente aprovado que tenha sido declarado isento do organismo prejudicial em testes oficiais ou controlados oficialmente, utilizando o método referido no n.º 6 do artigo 4.º

6 -Os testes referidos na alínea b) do número anterior devem ser realizados:

a)Quando tiver sido comprovada a presença do organismo prejudicial na própria produção de batata-semente:

b)Nos restantes casos ou em todas as plantas de selecção clonal inicial ou em amostras representativas da batata-semente base ou de material de propagação anterior.

Artigo 8.º

Notificação das medidas fitossanitárias

As medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar são objecto de notificações oficiais emanadas das DRAP, dirigidas às pessoas singulares e colectivas envolvidas.

Artigo 9.º

Encargos dos operadores económicos

Os encargos resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária referidas no número anterior são suportados pelos respectivos operadores económicos.

Artigo 10.º

Proibição

É proibida a posse e manuseamento do organismo prejudicial.

Artigo 11.º

Derrogações

Para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção varietal, a DGADR pode autorizar a não execução do disposto nos n.os 1 a 4 do artigo 7.º e no artigo 10.º, para efeitos de aplicação do Decreto-Lei n.º 91/98, de 14 de Abril, que estabelece as condições pelas quais determinados organismos prejudiciais, vegetais, produtos vegetais e outros materiais podem ser introduzidos ou circular na Comunidade ou em zonas protegidas para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção de variedades.

CAPÍTULO III

Regime contra-ordenacional

Artigo 12.º

Contra-ordenações

1 -As seguintes infracções constituem contra-ordenações puníveis com coima cujo montante mínimo é de (euro) 100 e máximo de (euro) 3740 ou mínimo de (euro) 250 e máximo de (euro) 44890, consoante o agente seja pessoa singular ou colectiva:

a)A omissão do dever de informação previsto no artigo 4.º;

b)O não cumprimento das medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar ao abrigo do artigo 8.º e em violação do disposto nos artigos 5.º e 7.º;

c)O não cumprimento dos encargos financeiros resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária a aplicar ao abrigo do artigo 8.º, em violação do disposto no artigo 9.º;

d)A posse e o manuseamento do organismo prejudicial, em violação do disposto no artigo 10.º

2 -A tentativa e a negligência são puníveis, sendo nesse caso reduzidos para metade os limites mínimos e máximos referidos no número anterior.

Artigo 13.º

Sanções acessórias

1 -Em função da gravidade da infracção e da culpa do agente, podem ser aplicadas, simultaneamente com as coimas, as seguintes sanções acessórias:

a)Perda de objectos pertencentes ao agente;

b)Interdição do exercício de profissões ou actividades cujo exercício dependa de título público ou de autorização ou de homologação de autoridade pública;

c)Privação do direito a subsídio ou benefício outorgado por entidades ou serviços públicos;

d)Privação do direito de participar em feiras ou mercados;

e)Encerramento de estabelecimento cujo funcionamento esteja sujeito a autorização de autoridade administrativa;

f)Suspensão de autorizações.

2 -As sanções previstas no número anterior têm a duração máxima de um ano.

3 -No caso de uma conduta contra-ordenacional ter ocasionado um grave risco de propagação do organismo prejudicial, deve ser dada publicidade à decisão condenatória definitiva de aplicação da coima, mediante a afixação de editais na sede da DRA da área onde foi praticada a infracção.

Artigo 14.º

Processos de contra-ordenação

Sem prejuízo das competências atribuídas por lei às autoridades policiais e fiscalizadoras, o levantamento dos autos e a instrução dos processos de contra-ordenação são da competência da DRAP da região em cuja área foi praticada a contra-ordenação, competindo ao director-geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a aplicação das coimas e sanções acessórias.

Artigo 15.º

Produto das coimas

a)Em 10% para a entidade que levantou o auto de contra-ordenação;

b)Em 10% para a entidade que instruiu o processo;

c)Em 20% para a entidade que aplicou a coima;

d)Em 60% para o Estado. CAPÍTULO IV Disposições finais

Artigo 16.º

Aplicação às Regiões Autónomas

1 -Sem prejuízo das competências atribuídas à DGADR na qualidade de autoridade fitossanitária nacional, as competências atribuídas pelo presente decreto-lei às DRAP são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos dos departamentos regionais competentes.

2 -As competências previstas no artigo 14.º são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos definidos pelos órgãos de governo próprio.

3 -As percentagens previstas no artigo 15.º provenientes das coimas aplicadas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira constituem receita própria de cada uma delas.

Artigo 17.º

Norma revogatória

É revogado o Decreto-Lei n.º 494/99, de 18 de Novembro.

Artigo 18.º

Remissão

1 -Plantas (incluindo tubérculos, com excepção da semente verdadeira, de Solanum tuberosum L. (Batata).

a)Em alturas apropriadas, inspecção visual da cultura em desenvolvimento e ou colheita de amostras de batata-semente e de batata consumo durante a época de cultura ou em armazém, sendo que essas amostras são sujeitas a uma inspecção visual oficial ou oficialmente controlada, com corte dos tubérculos; e

b)No caso da batata-semente e, quando apropriado, da batata consumo, análises laboratoriais oficiais ou oficialmente controladas, utilizando o método constante do anexo II.

i)2 minutos a 96ºC (desnaturação do ADN-alvo) 35 ciclos de:

ii)20 segundos a 94ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii)20 segundos a 68ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv)30 segundos a 72ºC (extensão da cópia) 1 ciclo de:

v)10 minutos a 72ºC (extensão final)

vi)Manter a uma temperatura de 4ºC Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador Perkin Elmer 9600. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

2 -Plantas, com excepção de frutos e sementes de Lycopersicon Lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. (Tomate). SECÇÃO II Prospecções

a)Estimativa da superfície total de cultura de batata-sememte e de batata consumo, em hectares;

b)Descriminação por categoria de semente e calibre e, quando apropriado por região;

c)Número e data das amostras colhidas para análise;

d)Número de inspecções visuais da cultura;

e)Número (e dimensão da amostra) de inspecções visuais de tubérculos.

f)Examinar o esfregaço corado coberto com uma gota de óleo de imersão em microscópio de epifluorescência a 450 nm, utilizando uma objectiva de imersão em óleo ou água e uma ampliação de 600-1000X;

g)Os grânulos de PHB apresentam uma fluorescência laranja viva. Observar também com luz normal transmitida para verificar se os grânulos são intracelulares e se a morfologia das células é típica de R. solanacearum. Teste do negro de Sudão:

i)5 minutos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo) 35 ciclos de:

ii)30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii)30 segundos a 68ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv)45 segundos a 72ºC (extensão da cópia) 1 ciclo de:

v)5 minutos a 72ºC (extensão final)

vi)Manter a uma temperatura de 4ºC Nota. - Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

3 -Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras: (ver documento original) SECÇÃO II Métodos pormenorizados de detecção de R. Solanacearum em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de pus ou mal murcho

a)Retirar o exsudado ou secções do tecido necrosado do anel vascular do tubérculo ou da zona vascular do caule da planta de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão. Efectuar uma suspensão num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice n.º 4) e deixar em repouso durante 5 a 10 minutos;

b)Preparar uma série de diluições decimais da suspensão;

c)Transferir 50-100 (mi)l da suspensão para um meio nutritivo geral (NA, YPGA ou SPA, ver apêndice n.º 2) e ou para o meio de tetrazólio de Kelman (apêndice n.º 2) e ou para um meio selectivo validado (por exemplo, SMSA, ver apêndice n.º 2). Espalhar ou efectuar um reticulado com uma técnica adequada de diluição em placas. Se necessário, preparar um conjunto separado de placas com uma suspensão diluída de células de R. solanacearum Biovar 2 como controlo positivo;

d)Incubar as placas durante 2 a 6 dias a 28ºC: Em meios nutritivos gerais, os isolados virulentos de R. solanacearum produzem colónias de cor branco-pérola, achatadas, irregulares e fluidas, exibindo muitas vezes espirais características no centro. Formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas de coloração esbranquiçada; Nos meios de tetrazólio de Kelman e SMSA, as espirais são de cor vermelha viva. As formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas que são completamente vermelho-escuras.

i)5 minutos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo) 35 ciclos de:

ii)30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii)30 segundos a 58ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv)45 segundos a 72ºC (extensão da cópia) 1 ciclo de:

v)5 minutos a 72ºC (extensão final)

4 -Testes de identificação de R. solanacearum: Testes para confirmar a identidade de presumíveis isolados de R. solanacearum são descritos na parte B da secção VI. SECÇÃO III

a)PCR específica para os Biovares 1 e 2: (ver documento original)

b)PCR específica para os Biovares 3, 4 e 5: (ver documento original)

c)Na primeira época de colheita de batata ou tomate subsequente ao período especificado na alínea anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro e de outras plantas hospedeiras, incluindo solanáceas infestantes, durante inspecções oficiais em, pelo menos, dois períodos de cultura consecutivos anteriores à plantação:

d)Na época de colheita de batata ou de tomate seguinte à referida na alínea anterior, e após um ciclo de rotação adequado, que é de dois anos, no mínimo, se se pretender cultivar batata-semente, é efectuada uma prospecção oficial nos termos do artigo 3.º;

e)Realizar uma prospecção oficial nos termos do artigo 3.º

i)5 minutos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo) 35 ciclos de:

ii)30 segundos a 95ºC (desnaturação do ADN-alvo)

iii)30 segundos a 58ºC (emparelhamento dos iniciadores)

iv)45 segundos a 72ºC (extensão da cópia) 1 ciclo de:

v)5 minutos a 72ºC (extensão final)

5 -Teste IF: Princípio: A utilização do teste IF como teste de rastreio essencial é recomendada, tendo em conta a sua robustez comprovada para alcançar os limiares de detecção exigidos. Sempre que se utilize o teste IF como teste de rastreio essencial e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento, o teste PCR ou o teste FISH como segundo teste de rastreio. Sempre que se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar a análise. Nota. - Utilizar anticorpos validados para R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), de acordo com as recomendações do fabricante. Todos os anti-soros policlonais validados têm um título de IF de 1:2000 no mínimo. Durante o teste os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas do título ou no seu valor exacto. O teste deve ser realizado com extractos de amostras recentemente preparados. Se necessário, pode ser executado com sucesso com extractos armazenados entre 68 e 86ºC e conservados em glicerol. O glicerol pode ser retirado da amostra através da adição de 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4), nova centrifugação durante 15 minutos a 7000 g e ressuspensão num volume igual de tampão de ressuspensão. Este procedimento é frequentemente desnecessário, em especial se as lâminas forem fixadas à chama. Preparar lâminas de controlo positivo em separado com uma estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice n.º 3 ou opcionalmente em tampão. Sempre que possível, deve também ser utilizado material vegetal naturalmente infectado (liofilizado ou congelado a uma temperatura compreendida entre 16 e 24ºC) como controlo positivo na mesma lâmina. Como controlos negativos, podem ser utilizadas alíquotas de extracto de amostra que se tenham anteriormente revelado negativas relativamente à presença de R. solanacearum. Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são referidos no apêndice n.º 3. Utilizar lâminas de microscópio com vários poços, de preferência 10, com, pelo menos, 6 mm de diâmetro cada. Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

i)Para sedimentos com relativamente pouco amido: Pipetar um volume-padrão (15 (mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma diluição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume similar de sedimento não diluído (1/1) nos restantes poços da fila. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 1;

ii)Para outros sedimentos: Preparar diluições decimais (1/10, 1/100) do sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume-padrão (15 (mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) do sedimento ressuspenso e de cada uma das diluições numa fila de poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 2.

6 -Testes PCR: Princípios: Sempre que se utilize PCR como teste de rastreio principal e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste PCR como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico. A exploração completa deste método como teste de rastreio principal é apenas recomendada quando tenham sido adquiridos conhecimentos altamente especializados. Nota. - Os resultados preliminares obtidos com este teste deveriam permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que apresentaram anteriormente resultados negativos. Podem ser necessárias experiências de optimização para alcançar os níveis máximos de sensibilidade e especificidade em todos os laboratórios. Utilizar os reagentes e protocolos PCR validados (ver apêndice n.º 6). Seleccionar, de preferência, um método que disponha de um controlo interno. Tomar as precauções necessárias para evitar a contaminação da amostra com ADN-alvo. O teste PCR deve ser realizado por técnicos experimentados, em laboratórios de biologia molecular especializados, no sentido de minimizar a possibilidade de contaminação com ADN-alvo. Os controlos negativos (para os procedimentos de extracção de ADN e PCR) devem ser sempre manipulados como amostras finais no procedimento, a fim de evidenciar a ocorrência de qualquer contaminação com ADN. Devem ser incluídos no teste PCR os seguintes controlos negativos: Extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado e se tenha revelado negativo relativamente à presença de R. solanacearum; Controlos dos tampões utilizados para extrair a bactéria e o ADN da amostra; Mistura de reacção de PCR. Devem ser incluídos os seguintes controlos positivos: Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se adicionou R. solanacearum (ver preparação na parte B do apêndice n.º 3); Uma suspensão em água contendo 10(elevado a 6) células por ml de um isolado virulento de R. solanacearum (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver parte B do apêndice n.º 3); Se possível, utilizar também ADN extraído de amostras positivas ao realizar o teste PCR. Nota. - Para evitar uma potencial contaminação, os controlos positivos deverão ser preparados num ambiente separado do das amostras a serem testadas. Os extractos de amostras devem estar, o mais possível, isentos de terra. É, por isso, prudente, em certos casos, preparar os extractos a partir de material vegetal, caso se utilizem os testes PCR. Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste estão mencionados no apêndice n.º 3.

a)Método de acordo com Pastrik (2000): 1) Pipetar 220 (mi)l de tampão de lise (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 8,0], EDTA 1 mM [pH 8,0]) para um tubo Eppendorf de 1,5 ml; 2) Adicionar 100 (mi)l de extracto de amostra e colocar num bloco de aquecimento ou em banho-maria a 95ºC durante 10 minutos; 3) Colocar o tubo em gelo durante 5 minutos; 4) Adicionar 80 (mi)l de solução concentrada de lisozima (50 mg de lisozima por ml em Tris HCl 10 mM, pH 8,0) e incubar a 37ºC durante 30 minutos; 5) Adicionar 220 (mi)l de solução A Easy DNA(R) (Invitrogen), misturar bem em vortex e incubar a 65ºC durante 30 minutos; 6) Adicionar 100 (mi)l de solução B Easy DNA(R) (Invitrogen), agitar vigorosamente em vortex até que o precipitado se desloque livremente no tubo e a amostra esteja uniformemente viscosa; 7) Adicionar 500 (mi)l de clorofórmio e agitar em vortex até que a viscosidade diminua e a mistura se torne homogénea; 89 Centrifugar a 15000 g durante 20 minutos a 4ºC para separar as fases e formar a interfase; 9) Transferir a fase superior para um novo tubo Eppendorf; 10) Adicionar 1 ml de etanol a 100% (-20ºC), agitar brevemente em vortex e incubar no gelo durante 10 minutos; 11) Centrifugar a 15000 g durante 20 minutos a 4ºC e remover o etanol do sedimento; 12) Adicionar 500 (mi)l de etanol a 80% (-20ºC) e misturar invertendo o tubo; 13) Centrifugar a 15000 g durante 10 minutos a 4ºC, guardar o sedimento e remover o etanol; 14) Deixar secar o sedimento ao ar ou em «DNA speed vac»; 15) Ressuspender o sedimento em 100 (mi)l de água ultra pura (UPW) esterilizada e deixar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 20 minutos; 16) Armazenar a 20ºC até ser necessário para a realização de PCR; 17) Centrifugar qualquer precipitado branco até que este se deposite no fundo e utilizar 5 (mi)l do sobrenadante contendo ADN para PCR.

b)Outros métodos: Podem ser aplicados outros métodos de extracção de ADN, por exemplo o Qiagen DNeasy Plant Kit, desde que esteja provado que são igualmente eficazes na purificação do ADN a partir de amostras de controlo contendo 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células do patogéneo por ml.

7 -Teste FISH: Princípio: Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste FISH como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico. Nota. - Utilizar sondas validadas específicas para R. solanacearum (apêndice n.º 7). O teste preliminar com este método deveria permitir a detecção reprodutível de, pelo menos, 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que se revelaram negativos. O procedimento seguinte deve ser realizado, de preferência, com um extracto de amostra preparado na altura da utilização, mas pode também ser realizado com sucesso com um extracto de amostra que tenha sido armazenado em glicerol a uma temperatura compreendida entre -16 e 24ºC ou 68 e 86ºC. Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum. Como controlos positivos preparar suspensões contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células de R. solanacearum Biovar 2 por ml (por exemplo, estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver apêndice n.º 3) em tampão fosfato (PB) 0,01 M, a partir de uma cultura com 3 a 5 dias. Preparar lâminas de controlo positivo em separado com a estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice n.º 3. A utilização de sondas para eubacterias marcadas com FITC oferece um controlo para o processo de hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na amostra ficarão coradas. Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste são enumerados na parte A do apêndice n.º 3. Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

a)Meio geral de crescimento: Agar nutritivo (NA) Agar nutritivo (Difco) - 23,0 g Água destilada - 1,0 l Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Agar com extracto de levedura, peptona e glucose (YPGA) Extracto de levedura (Difco) - 5,0 g Bacto-Peptona (Difco) - 5,0 g D(+)glucose mono-hidratada - 10,0 g Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g Água destilada - 1,0 l Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Agar de sacarose e peptona (SPA) Sacarose - 20,0 g Bacto-Peptona (Difco) - 5,0 g K(índice 2)HPO(índice 4) - 0,5 g MgSO(índice 4) . 7H(índice 2)O - 0,25 g Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g Água destilada - 1,0 l pH 7,2-7,4 Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Meio de tetrazólio de Kelman Casaminoácidos (Difco) - 1,0 g Bacto-Peptona (Difco) - 10,0 g Dextrose - 5,0 g Bacto-Agar (Difco) - 15,0 g Água destilada - 1,0 l Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Arrefecer até 50ºC e adicionar o volume necessário de solução de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (Sigma), esterilizada por filtração, para obter uma concentração final de 50 mg por l.

b)Meios de crescimento selectivo validados: Meio SMSA (Englebrecht, 1994 modificado por Elphinstone et al., 1996) Meio basal Casaminoácidos (Difco) - 1,0 g Bacto-Peptona (Difco) - 10,0 g Glicerol - 5,0 ml Bacto-Agar (Difco), ver Nota 2. - 15,0 g Água destilada - 1,0 l Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Arrefecer até 50ºC e adicionar o volume necessário de soluções aquosas concentradas, esterilizadas por filtração, dos seguintes ingredientes para obter as concentrações finais especificadas: Violeta cristal (Sigma C-0775) - 5 mg por l Sulfato de polimixina B (Sigma P-1004) 600000 U (aproximadamente 100 mg) por l Bacitracina (Sigma B-0125) - 1250 U (aproximadamente 25 mg) por l Cloranfenicol (Sigma C-3175) - 5 mg por l Penicilina-G (Sigma P-3032) - 825 U (aproximadamente 0,5 mg) por l Cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (Sigma T-8877) - 50 mg por l Nota. - A utilização de reagentes diferentes dos acima especificados pode afectar o crescimento de R. solanacearum. Pode utilizar-se agar Oxoid #1 em vez de Bacto-agar (Difco). Neste caso, o crescimento de R. solanacearum será mais lento, embora o crescimento dos saprófitas competidores possa também ser reduzido. A formação de colónias típicas de R. solanacearum pode demorar mais 1-2 dias e a coloração vermelha pode ser mais clara e mais difusa do que em Bacto-agar. O aumento da concentração de bacitracina para 2500 U por l pode reduzir as populações de bactérias competidoras sem afectar o crescimento de R. solanacearum. Armazenar os meios e as soluções concentradas de antibióticos a 4ºC, no escuro, e utilizar no prazo de um mês. As placas devem estar livres de condensação superficial antes da utilização. Evitar a secagem excessiva das placas. Após a preparação de cada novo lote de meio deve efectuar-se um controlo de qualidade mediante o espalhamento de uma suspensão de uma cultura de referência de R. solanacearum (ver apêndice n.º 3), observando a formação de colónias típicas após incubação a 28ºC durante 2-5 dias.

c)Meios de enriquecimento validados: Meio líquido SMSA (Elphinstone et al., 1996) Preparar de forma idêntica à do meio selectivo SMSA contendo agar, mas excluindo o Bacto-agar e o cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio. Meio líquido de Wilbrink modificado (Caruso et al., 2002) Sacarose - 10 g Proteose peptona - 5 g K(índice 2)HPO(índice 4) - 0,5 g MgSO(índice 4) - 0,25 g NANO(índice 3) - 0,25 g Água destilada - 1 l Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos e arrefecer até 50ºC Adicionar soluções concentradas de antibióticos como para o meio líquido SMSA. APÊNDICE N.º 3 Parte A Material de controlo normalizado disponível no mercado

i)Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH quando se observarem, com um filtro para FITC, células brilhantes com fluorescência verde de dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum e, com o filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha em todos os controlos positivos, as quais deverão estar ausentes em todos os controlos negativos. Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 4). As amostras com, pelo menos, 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas como potencialmente contaminadas. A realização de outros testes é obrigatória. As amostras com menos de 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas negativas;

ii)O teste FISH é negativo se, com um filtro para rodamina, não se observarem células brilhantes com fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum, e sejam observadas células típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas preparações de controlo positivo.

8 -Testes ELISA: Princípio: O teste ELISA só pode ser utilizado como teste opcional em complemento de testes IF, PCR ou FISH, devido à sensibilidade relativamente baixa deste teste. Quando se utiliza o teste DAS ELISA, é obrigatório efectuar o enriquecimento e utilizar anticorpos monoclonais (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Pode ser útil efectuar um enriquecimento das amostras antes de utilizar o teste ELISA a fim de aumentar a sensibilidade deste teste, mas esse enriquecimento pode ser infrutífero devido à concorrência de outros organismos presentes na amostra. Nota. - Utilizar anticorpos validados para R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a conjugados de anticorpos secundários adequados, de acordo com as recomendações do fabricante. Durante os testes, os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas ou no título da formulação comercial. Determinar o título dos anticorpos com uma suspensão de 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum. Incluir como controlo negativo um extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum e uma suspensão de uma bactéria que não origine reacção cruzada em tampão fosfato salino (PBS). Como controlo positivo, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo, inoculadas com 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células por ml de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver partes A e B do apêndice n.º 2). Para a comparação dos resultados de cada placa, utilizar uma suspensão padrão de 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células de R. solanacearum por ml em PBS. Assegurar-se de que os controlos positivos estão bem separados da(s) amostra(s) em estudo na microplaca. Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são descritos na parte A do apêndice n.º 3. Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s). Foram validados dois protocolos ELISA.

a)Teste ELISA indirecto (Robinson Smith et al.,1995): 1) Utilizar alíquotas de 100-200 (mi)l de extracto de amostra. (O aquecimento a 100ºC durante 4 minutos em banho-maria ou num bloco de aquecimento pode, nalguns casos, reduzir os resultados não específicos); 2) Adicionar um volume igual de tampão de revestimento 2 x (apêndice n.º 4) e agitar em vortex; 3) Colocar alíquotas de 100 (mi)l em, pelo menos, dois dos poços de uma microplaca (por exemplo NuncPolysorp ou equivalente) e incubar durante 1 hora a 37ºC ou durante a noite a uma temperatura de 4ºC; 4) Retirar os extractos dos poços. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4), deixando a última solução de lavagem dentro dos poços durante, pelo menos, 5 minutos, 5) Preparar uma diluição adequada de anticorpos contra R. solanacearum em tampão de bloqueio (apêndice n.º 4). Para anticorpos comerciais validados, utilizar as diluições recomendadas (geralmente uma concentração duas vezes superior ao título); 6) Adicionar 100 (mi)l a cada poço e incubar durante 1 hora a 37ºC; 7) Retirar a solução de anticorpos dos poços e lavar como anteriormente (n.º 4); 8) Preparar uma diluição adequada de conjugado anticorpo secundário - fosfatase alcalina em tampão de bloqueio. Adicionar 100 (mi)l a cada poço e incubar durante 1 hora a 37ºC; 9) Retirar o anticorpo conjugado dos poços e lavar como anteriormente (n.º 4); 10) Adicionar 100 (mi)l de solução de substrato de fosfatase alcalina (apêndice n.º 4) a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

b)DASI ELISA: 1) Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas policlonais anti-R. solanacearum em tampão de revestimento, pH 9,6 (apêndice n.º 4). Adicionar 200 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 4-5 horas ou a 4ºC durante 16 horas; 2) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4); Nota. - Adicionar 190 (mi)l de extracto de amostra em, pelo menos, dois poços. Adicionar também controlos positivos e negativos em dois poços de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4ºC. 3) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4); 4) Preparar uma diluição adequada de anticorpos monoclonais específicos contra R. solanacearum em PBS (apêndice n.º 4) que contenha também 0,5% de albumina de soro de bovino (BSA) e adicionar 190 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 2 horas; 5) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4); 6) Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas anti-rato conjugadas com fosfatase alcalina em PBS. Adicionar 190 (mi)l a cada poço. Incubar a 37ºC durante 2 horas; 7) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4); 8) Preparar uma solução de substrato de fosfatase alcalina que contenha 1 mg de fosfato de p-nitrofenilo por ml de tampão de substrato (apêndice n.º 4). Adicionar 200 (mi)l a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos. Interpretação do resultado do teste ELISA: O teste ELISA é negativo se a média das leituras da densidade óptica (DO) dos poços de amostras duplicadas for (menor que)2 x DO do poço de controlo negativo do extracto de amostra, desde que as DO dos controlos positivos sejam todas superiores a 1,0 (após 90 minutos de incubação com o substrato) e sejam superiores ao dobro da DO obtida para os extractos de amostras negativas. O teste ELISA é positivo se a DO média dos poços de amostras duplicadas for (maior que) 2 x DO do poço de extracto de amostra negativa, desde que as DO de todos os poços de controlo negativo sejam (menor que) 2 x as DO dos poços de controlo positivo. Uma leitura ELISA negativa nos poços de controlo positivo indica que o teste não foi efectuado correctamente ou que ocorreram inibições. Uma leitura ELISA positiva nos poços de controlo negativo indica que ocorreu contaminação cruzada ou uma ligação não específica de anticorpos.

9 -Bioensaio: Nota. - Um ensaio preliminar com este teste deveria permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) unidades formadoras de colónias de R. solanacearum por ml adicionadas a amostras de extractos para as quais se obtiveram anteriormente resultados negativos (para a preparação, ver apêndice n.º 3). Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada quando se utiliza uma amostra de extracto recentemente preparada e condições de crescimento óptimas. No entanto, o método pode ser aplicado com sucesso a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre 68 e 86ºC. O protocolo seguinte tem por base Janse (1988):

10 -Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

11 -Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

12 -Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

13 -Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

14 -Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

15 -Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

16 -Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

17 -Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic finger-prints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

18 -Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

19 -Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

20 -Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

21 -Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

22 -Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

23 -Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

24 -Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

25 -Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

26 -Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

27 -Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

28 -Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

29 -Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

30 -Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. ANEXO III Ocorrência suspeita e confirmação da presença do organismo prejudicial