Decreto-Lei n.º 494/99

Artigo 1.º

Objecto

O presente diploma estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., anteriormente designada por Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, que para efeitos do presente diploma é a seguir designada por organismo prejudicial, no sentido de evitar o seu aparecimento e, uma vez detectada, localizá-la e determinar a sua distribuição, evitar a sua dispersão e combatê-la com vista à sua erradicação.

Artigo 2.º

Prospecção oficial

1 -Para efeitos do disposto no artigo anterior, a Direcção-Geral de Protecção das Culturas (DGPC) define, elabora e coordena a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, cuja execução se realiza anualmente.

2 -A execução do programa de prospecção referido no número anterior cabe aos serviços competentes das direcções regionais de agricultura (DRA), nas respectivas áreas de actuação.

3 -As prospecções previstas no programa nacional de prospecção incidem obrigatoriamente sobre as seguintes plantas, que para efeitos do presente diploma são designadas «materiais vegetais»:

a)No caso da batata: plantas, incluindo tubérculos, com excepção da semente verdadeira, de Solanum tuberosum L.:

b)No caso do tomate: plantas, com excepção de frutos e sementes, de Lycopersicum lycopersicum (L.) Karsten ex Farw:

4 -De acordo com a avaliação do risco de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.º 1, as prospecções podem ser realizadas em zonas de produção de batata, tomate e outras solanáceas e em viveiros de tomateiro, assim como em locais de transformação industrial e centros de embalagem.

5 -De acordo com a avaliação do risco de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.º 1, as prospecções podem incidir sobre outras plantas solanáceas para além dos materiais vegetais referidos no n.º 3 e infestantes da mesma família, águas superficiais utilizadas para rega dos materiais vegetais, resíduos líquidos de descarga e resíduos sólidos provenientes de instalações de transformação industrial de batata e tomate ou de embalagem de batata, meios de cultura e solo, que para efeitos do presente diploma são a seguir designados por outros materiais.

6 -O método de diagnóstico, detecção e identificação do organismo prejudicial nos materiais vegetais será o referido no anexo I ao presente diploma e que dele faz parte integrante, devendo ser utilizado qualquer outro método adequado e aprovado pelos órgãos competentes para os outros materiais.

7 -A DGPC procederá anualmente ao envio dos resultados da execução do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial à Comissão das Comunidades Europeias.

Artigo 3.º

Dever de informação em relação ao organismo prejudicial

Qualquer pessoa que saiba ou suspeite da presença do organismo prejudicial em qualquer dos materiais vegetais ou outros materiais definidos no presente diploma deve dar conhecimento do facto à DGPC.

Artigo 4.º

Procedimentos no caso de suspeita da presença do organismo prejudicial

1 -Qualquer pessoa que detenha, produza, importe ou comercialize materiais vegetais ou outros materiais suspeitos de estarem contaminados pelo organismo prejudicial é notificada desse facto pela DRA competente e não poderá utilizá-los para qualquer fim até que seja comprovado oficialmente, através dos testes laboratoriais referidos no n.º 6 do artigo 2.º, que aqueles materiais não apresentam risco de dispersão do organismo prejudicial em questão.

2 -Na pendência da confirmação da presença do organismo prejudicial, através dos testes laboratoriais referidos no n.º 6 do artigo 2.º, deve, desde logo, ser garantida a retenção e conservação adequada:

a)Do lote ou parte do mesmo em que foi colhida a amostra com a embalagem e rótulo originais;

b)Da parte restante das amostras;

c)De qualquer extracto restante e outro material preparado para o(s) teste(s) de rastreio, por exemplo, lâminas de imunofluorescência;

d)De toda a documentação.

Artigo 5.º

Procedimentos no caso de confirmação da presença do organismo prejudicial

1 -Sempre que a presença do organismo prejudicial seja confirmada através dos testes laboratoriais referidos no n.º 6 do artigo 2.º, deverá ser garantida a retenção e conservação adequada, durante pelo menos um mês após a obrigatória notificação à Comissão das Comunidades Europeias e aos restantes Estados membros a realizar pela DGPC, dos seguintes elementos:

a)Do material especificado no n.º 2 do artigo anterior;

b)De uma amostra do material contaminado da planta de tomate ou de beringela inoculada com o extracto do tubérculo ou da planta, se for caso disso;

c)De uma cultura isolada do referido organismo prejudicial.

2 -A confirmação da presença do organismo prejudicial obriga à notificação das pessoas definidas no n.º 1 do artigo anterior que estejam implicadas, a efectuar pela DRA competente, na qual constará a informação adequada de acordo com o previsto no artigo 6.º

3 -A confirmação da presença do organismo prejudicial implica a realização de investigações oficiais para determinar a extensão e fonte primária da contaminação, nos termos do disposto no anexo II ao presente diploma e que dele faz parte integrante.

4 -Com base na possível extensão da contaminação será demarcada uma zona, a qual será objecto de divulgação oficial.

5 -Os elementos a ter em conta para a determinação da extensão provável da contaminação serão os constantes no anexo III ao presente diploma e que dele faz parte integrante.

Artigo 6.º

Medidas de protecção fitossanitária

1 -Os materiais vegetais e outras plantas solanáceas são declarados contaminados pela DRA competente sempre que confirmada a presença do organismo prejudicial nos termos do artigo anterior, não podendo ser plantados e ficando sujeitos a um dos procedimentos constantes do anexo IV ao presente diploma, que dele faz parte integrante, sob controlo e aprovação oficiais.

2 -As águas superficiais são declaradas contaminadas pela DRA competente sempre que confirmada a presença do organismo prejudicial, não podendo ser utilizadas para irrigação, aspersão ou inundação de locais de produção de materiais vegetais e outras plantas solanáceas.

3 -Os materiais vegetais e outras plantas solanáceas são considerados como provavelmente contaminados pela DRA competente quando tenham estado em contacto pré ou pós-colheita ou por relação de produção, irrigação ou relação clonal com a contaminação declarada, não podendo ser plantados e ficando sujeitos a um dos procedimentos constantes do anexo V ao presente diploma, que dele faz parte integrante, sob controlo e aprovação oficial.

4 -Todas as máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, declarados contaminados ou considerados provavelmente contaminados nos termos dos números anteriores devem ser destruídos ou descontaminados segundo os métodos adequados a que se refere o artigo 7.º

5 -Nos casos previstos no n.º 1, são automaticamente declarados contaminados os locais de produção, aplicando-se as medidas previstas no anexo VI ao presente diploma e que dele faz parte integrante.

6 -As medidas a aplicar na eventual zona demarcada são as que se encontram igualmente dispostas no anexo VI ao presente diploma.

7 -Os equipamentos de eliminação de resíduos devem obedecer às disposições constantes do anexo VII ao presente diploma e que dele faz parte integrante.

Artigo 7.º

Métodos de descontaminação

Os métodos adequados para a descontaminação dos objectos referidos no n.º 4 do artigo anterior serão a lavagem e a desinfecção, quando necessário, de forma a garantir que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial, devendo a sua aplicação ter lugar sob supervisão dos serviços competentes da respectiva DRA.

Artigo 8.º

Proibição

É proibida a posse e manuseamento do organismo prejudicial.

Artigo 9.º

Excepções

A DGPC poderá autorizar excepções às medidas previstas nos artigos 6.º e 7.º nos termos do disposto no Decreto-Lei n.º 91/98, de 14 de Abril, para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção de variedades.

Artigo 10.º

Infracções

1 -As infracções ao disposto nos artigos 4.º, n.º 1, e 8.º, o não cumprimento dos termos da notificação prevista no n.º 2 do artigo 5.º, o não cumprimento das medidas indicadas nos anexos ao presente diploma e o não cumprimento dos termos da autorização prevista no artigo 9.º constituem contra-ordenações puníveis com coima cujo montante mínimo é de 10000$00 e máximo de 750000$00 ou 9000000$00, consoante se trate de pessoa singular ou colectiva.

2 -A tentativa e a negligência são puníveis.

3 -Podem ser aplicadas simultaneamente com as coimas as seguintes sanções acessórias:

a)Interdição do exercício de profissões ou actividades cujo exercício dependa de título público ou de autorização ou homologação de autoridade pública;

b)Privação do direito a subsídio ou benefício outorgado por entidades ou serviços públicos;

c)Privação do direito de participar em feiras ou mercados.

4 -O produto das coimas reverte:

a)Em 20% para a DGPC;

b)Em 20% para a DRA;

c)O restante para o Estado.

Artigo 11.º

Competência em matéria contra-ordenacional

1 -Diagnóstico do mal murcho em tubérculos de batateira e em plantas de batateira e de tomateiro. - Este procedimento destina-se a tubérculos de batateira e a plantas de batateira e de tomateiro com sintomas típicos ou suspeitos de mal murcho. Implica um teste rápido de rastreio, isolamento do agente patogénico a partir do tecido vascular infectado em meios de cultura adequados e, em caso de resultado positivo, identificação da cultura como Ralstonia solanacearum. Apresentação do fluxograma (ver esquema no documento original)

a)Os materiais vegetais cultivados num local de produção que tenha sido declarado contaminado ao abrigo do n.º 5 do artigo 6.º;

b)Local(is) de produção com ligações de produção aos materiais vegetais declarados contaminados, nos termos do n.º 1 do artigo 6.º, incluindo os que partilham equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum;

c)Os materiais vegetais produzidos no(s) local(is) de produção referido(s) na alínea anterior, ou que tenham estado presentes nesse(s) local(is) durante o período em que os materiais vegetais declarados contaminados se encontravam nos locais de produção referidos na alínea a);

d)Armazéns que lidem com os materiais vegetais dos locais de produção acima referidos;

e)Quaisquer máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, que possam ter estado em contacto com os materiais vegetais declarados contaminados;

f)Quaisquer materiais vegetais que tenham estado armazenados em, ou em contacto com, qualquer das estruturas ou objectos referidos na alínea anterior, antes da lavagem e desinfecção dessas estruturas e objectos;

g)Em resultado das investigações e dos testes referidos no n.º 3 do artigo 5.º e no n.º 6 do artigo 2.º do presente diploma, no caso da batata, os tubérculos ou plantas que tenham uma relação clonal colateral ou parental e, no caso do tomate, as plantas que tenham a mesma origem que os materiais vegetais declarados contaminados e em relação aos quais, embora os testes se tenham revelado negativos no que diz respeito ao organismo prejudicial, a contaminação se afigure provável através de uma ligação clonal;

h)Local(is) de produção dos materiais vegetais referidos na alínea anterior;

i)Incubar a amostra a uma temperatura de 25ºC-30ºC durante um período de até duas semanas, para favorecer a multiplicação das baixas populações de Ralstonia solanacearum;

ii)Lavar os tubérculos em água corrente com desinfectantes e detergentes adequados e secá-los ao ar.

iii)Transferir os hilos para um saco de maceração descartável forte (por exemplo, um saco Stomacher com 105 mm x 50 mm, esterilizado por radiação). Esmagar cuidadosamente os hilos com uma ferramenta adequada, por exemplo, um martelo, até à homogeneização completa. Adicionar um volume suficiente de tampão de maceração, de forma a cobrir o material. Deixar o macerado sedimentar durante quinze a trinta minutos.

j)Materiais vegetais produzidos em campos inundados por águas superficiais de que esteja confirmada a contaminação pelo organismo prejudicial.

2 -Detecção e identificação de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira. - Este procedimento destina-se à detecção de infecções latentes em tubérculos de batateira por um ou, de preferência, mais testes de rastreio que, se positivos, são complementados pelo isolamento do patogéneo, seguido, no caso do isolamento de colónias típicas, da identificação de uma cultura pura como Ralstonia solanacearum. Apresentação do fluxograma (ver esquema no documento original) SECÇÃO II Diagnóstico do mal murcho em tubérculos de batateira e em plantas de batateira e de tomateiro

a)Teste de exsudação do caule: A presença de Ralstonia solanacearum em caules de batateira com sintomas de murchidão pode ser avaliada através de um simples teste inicial: cortar o caule imediatamente acima do nível do solo. Colocar a superfície cortada num recipiente com água. Pouco tempo depois, haverá uma exsudação bacteriana espontânea a partir do anel vascular. Qualquer outra bactéria que provoque infecção vascular em plantas de batateira não exibirá este fenómeno.

b)Detecção de grânulos de poli-(beta)-hidroxibutirato (PHB): Os grânulos de PHB nas células de Ralstonia solanacearum são visualizados através da coloração com azul-de-nilo A ou com negro-de-sudão B. Preparar um esfregaço a partir do exsudado ou com uma suspensão do tecido necrosado numa lâmina de microscópio, ou então preparar um esfregaço de uma cultura de quarenta e oito horas em YPGA ou SPA, tal como descrito no apêndice n.º 1. Preparar esfregaços de controlo positivo da estirpe Biovar 2/Raça 3 e, se necessário, um esfregaço de uma estirpe heteróloga como controlo negativo. Deixar secar. Passar rapidamente a parte de baixo da lâmina à chama várias vezes até que o esfregaço esteja fixado.

c)Teste do azul-de-nilo: 1) Corar o esfregaço fixado na lâmina com uma solução aquosa a 1% de azul-de-nilo A. Incubar durante dez minutos a uma temperatura de 55ºC; 2) Escorrer a solução corante. Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel de filtro; 3) Lavar o esfregaço com uma solução aquosa a 8% de ácido acético. Incubar durante um minuto à temperatura ambiente; 4) Lavar com cuidado em água da torneira corrente. Secar com papel de filtro; 5) Voltar a humedecer com uma gota de água. Cobrir com uma lamela; 6) Examinar o esfregaço corado em microscópio de epifluorescência a 450 nm com lente de imersão em óleo e uma ampliação de 1000 vezes. Os grânulos de PHB apresentam uma fluorescência laranja-viva. Observar também com luz normal para verificar se os grânulos são intracelulares e se a morfologia das células é típica de Ralstonia solanacearum.

d)Teste do negro-de-sudão: 1) Corar o esfregaço fixado na lâmina com uma solução a 0,3% de negro-de-sudão B em etanol a 70%. Incubar durante dez minutos à temperatura ambiente; 2) Escorrer a solução corante. Lavar brevemente e com cuidado em água da torneira corrente. Retirar o excesso de água com papel de filtro; 3) Mergulhar o esfregaço brevemente em xilol. Secar com papel de filtro; Nota. - Cuidado! O xiloe é um produto nocivo. Trabalhar em «hotte». 4) Lavar o esfregaço com um solução aquosa a 0,5% (p/v) de safranina e deixar durante dez segundos à temperatura ambiente; Nota. - Cuidado! A safranina é um produto nocivo. Trabalhar em «hotte». 5) Lavar com cuidado em água corrente. Secar com papel de filtro. Cobrir com uma lamela; 6) Examinar o esfregaço corado em microscópio com luz transmitida com lente de imersão em óleo e uma ampliação de 1000 vezes. Os grânulos de PHB em células de Ralstonia solanacearum apresentam uma coloração azul-negra. As paredes celulares apresentam uma coloração rosa.

e)Outros testes: Outros testes de rastreio considerados apropriados são o teste IF, descrito no n.º 2 da secção III do presente anexo, o teste ELISA, como indicado no n.º 3 da secção III do presente anexo, e o teste PCR, descrito no n.º 4 da secção III do presente anexo.

i)Para sedimentos com relativamente pouco amido - pipetar um volume padrão de sedimento ressuspenso para cada um dos poços de uma fila (15 (mi)l é adequado para um poço com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume à escala para poços maiores). A fila de poços restante pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 1;

ii)Para outros sedimentos - preparar diluições decimais, isto é, 1/10, 1/100 e 1/1000, do sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume padrão (15 (mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume à escala para poços maiores) do sedimento ressuspenso e de cada uma das diluições numa fila de poços. A fila de poços restante pode ser utilizada como um duplicado ou para uma segunda amostra, como indicado na figura n.º 2.

iii)Se os números mais elevados (N > 10(elevado a 5) células por mililitro) de células, desigual ou incompletamente coradas ou fracamente fluorescentes forem observadas com o anti-soro no seu título, um segundo teste deve ser realizado: Ou um teste baseado num princípio biológico distinto; Ou uma repetição do teste IF, utilizando um segundo anti-soro ou uma diluição decimal do sedimento.

3 -Isolamento:

b)Noutros campos:

c)Imediatamente após a declaração de contaminação e em cada um dos anos de cultura subsequentes até à primeira campanha, inclusive, em que a colheita de batata ou de tomate seja autorizada no(s) campo(s) declarado(s) contaminado(s), nos termos da alínea a):

d)Numa unidade de produção de culturas protegidas declarada contaminada nos casos em que seja possível a total substituição do meio de cultura:

4 -Teste(s) de confirmação:

a)Testes nutricionais e enzimáticos: Nota. - Incluir estirpes apropriadas de controlo para cada teste utilizado. As seguintes características fenotípicas de Ralstonia solanacearum estão universalmente presentes ou ausentes: (ver quadro no documento original) Os meios de cultura e métodos de ensaio estão descritos em Lelliott & Stead, 1987.

b)Teste IF: Preparar uma suspensão de 10(elevado a 6) células por mililitro a partir da cultura e de uma estirpe de controlo. Preparar um série de diluições de anti-soro, com duas ordens de diluição. Aplicar o procedimento IF descrito no n.º 2 da secção III do presente anexo. O título de IF da cultura tem de ser equivalente ao do controlo positivo.

c)Teste ELISA: Preparar uma suspensão com uma concentração superior a 10(elevado a 6) células por mililitro a partir da cultura e de uma estirpe de controlo. Aplicar o procedimento ELISA (secção III, n.º 3). O valor ELISA da cultura tem de ser equivalente ao do controlo positivo.

d)Teste PCR: Preparar uma suspensão de 10(elevado a 6) células por mililitro a partir da cultura e de uma estirpe de controlo positivo. Aplicar o procedimento da PCR descrito no n.º 4 da secção III do presente anexo. O produto da PCR da cultura tem de ter a mesma dimensão e perfil de restrição (REA) do controlo positivo.

e)Hibridização fluorescente in situ (FISH): Preparar uma suspensão de 10(elevado a 6) células por mililitro da cultura e de uma estirpe de controlo. Aplicar o procedimento FISH (Van Beuningen et al., 1995) com o «primer» OLI-1 (Seal et al., 1993). A cultura tem de manifestar a mesma reacção que o controlo positivo.

f)Perfil proteico: As proteínas desnaturadas de células inteiras são separadas através de electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) (Stead, 1992a).

g)Perfil de ácidos gordos (FAP): Incubar a cultura e uma estirpe de controlo positivo durante quarenta e oito horas a uma temperatura de 28ºC em agar de soja tripticase e aplicar o procedimento FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). O perfil da cultura tem de ser idêntico ao do controlo positivo. Nas condições especificadas, os ácidos gordos característicos são 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH.

ii)Durante os cinco anos de cultura subsequentes à declaração de contaminação: 1) Serão tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira ou tomateiro, bem como outras plantas hospedeiras do organismo prejudicial, incluindo solanáceas infestantes; e 2) O campo será tratado e mantido, durante os primeiros três anos, em pousio completo ou plantado com cereais de acordo com o risco reconhecido, ou como pastagem permanente, com frequentes cortes ou com pastorícia intensiva, ou plantado com gramíneas destinadas à produção de semente, a que se seguirão dois anos em que serão plantadas plantas que não sejam hospedeiras do organismo prejudicial e para as quais não exista um risco reconhecido de sobrevivência ou dispersão do organismo prejudicial; 3) Na primeira época de colheita de batata ou tomate subsequente ao período especificado no número anterior:

5 -Teste de sementeira em placas com meio selectivo (baseado em Elphinstone et al., 1996):

i)Preparar, pelo menos, duas diluições decimais, ou seja, 1/10 e 1/100 ou mais, se consideradas necessárias, de sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume padrão (50(mi)l-100(mi)l) do sedimento ressuspenso e de cada diluição para meio selectivo SMSA modificado (apêndice n.º 7) e espalhar com uma vareta de vidro sobre toda a superfície do meio. Se for considerado útil, fazer uma diluição através de riscado com uma ansada de 10(mi)l de sedimento ressuspenso, passando a ansa pela chama entre cada uma das inoculações;

ii)Transferir um volume padrão (50(mi)l-100(mi)l) do sedimento ressuspenso para o meio selectivo SMSA modificado e espalhar com uma vareta de vidro sobre toda a superfície do meio. Repetir o procedimento, sem passar a vareta pela chama, em mais duas placas de SMSA modificado.

6 -Bio-ensaio (baseado em Janse, 1988):

7 -Teste de enriquecimento (baseado em Elphinstone et al., 1996):

8 -Teste de patogenicidade (v. secção II, n.º 4.3). APÊNDICE N.º 1 Meios nutritivos para isolamento e cultura de Ralstonia solanacearum Ágar nutritivo (NA) (ver quadro no documento original) Preparar volumes de 0,5 l de meio em frascos de 1 l. Dissolver os ingredientes. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante quinze minutos. Arrefecer a 50ºC. Preparar placas. Ágar de levedura-peptona-glucose (YPGA) (ver quadro no documento original) Preparar volumes de 0,5 l de meio em frascos de 1 l. Dissolver os ingredientes. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante quinze minutos. Arrefecer a 50ºC. Preparar placas. Ágar de sacarose e peptona (SPA) (ver quadro no documento original) Preparar volumes de 0,5 l de meio em frascos de 1 l. Dissolver os ingredientes. Se necessário, acertar o pH a 7,2-7,4. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante quinze minutos. Arrefecer a 50ºC. Preparar placas. Meio de tetrazólio de Kelman (ver quadro no documento original) Preparar volumes de 0,5 l de meio em frascos de 1 l. Dissolver os ingredientes. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante quinze minutos. Arrefecer a 50ºC. Adicionar o volume necessário de solução aquosa de cloreto de trifenil tetrazólio (Sigma), esterilizada por filtração, para obter uma concentração final de 50 mg/l. Preparar placas. APÊNDICE N.º 2 Materiais para a preparação das amostras Tampão de maceração: tampão fosfato 50 mM, pH 7,0 Este tampão é utilizado para maceração dos tecidos. (ver quadro no documento original) Dissolver os ingredientes e verificar o pH. Preparar as alíquotas que forem consideradas necessárias. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante quinze minutos. Para a realização do teste PCR directo, recomenda-se a adição de polivinilpirrolidona 40000 MWT (PVP-40) a 5%, para reduzir a incidência de inibição da amplificação por moléculas aromáticas presentes no extracto. No caso de se utilizarem os procedimentos de homogeneização com Waring Blender ou com Ultra Turrax para a maceração dos hilos de batata, recomenda-se a adição de um antifloculante, antiespuma ou antioxidante. (ver quadro no documento original) Esterilizar separadamente em autoclave. Adicionar de forma a obter a concentração desejada. Tampão de ressuspensão: tampão fosfato 10 mM, pH 7,2 Este tampão é utilizado para a ressuspensão e diluição dos sedimentos dos hilos de batata. (ver quadro no documento original) Dissolver os ingredientes e verificar o pH. Preparar as alíquotas que forem consideradas necessárias. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante quinze minutos. APÊNDICE N.º 3 Materiais para o teste IF Tampão IF: tampão fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2 Este tampão é utilizado para a diluição dos anti-soros. (ver quadro no documento original) Dissolver os ingredientes e verificar o pH. Preparar as alíquotas que forem consideradas necessárias. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante quinze minutos. Tampão IF-Tween Este tampão é utilizado para lavar as lâminas. Adicionar 0,1% de Tween 20 ao tampão IF. Tampão fosfato com glicerol 0,1 M, pH 7,6 Este tampão é utilizado como fluido de montagem sobre os poços das lâminas de IF, para aumentar a fluorescência. (ver quadro no documento original) APÊNDICE N.º 4 Determinação do nível de contaminação no teste IF

i)No diagnóstico do mal murcho em tubérculos de batateira e em plantas de batateira e de tomateiro;

ii)Na detecção de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira;

iii)Na identificação de Ralstonia solanacearum. Nos apêndices ao presente anexo, são fornecidos pormenores para a preparação dos materiais a utilizar nas análises, isto é, meios de cultura, tampões, soluções e reagentes. Quadro síntese do esquema de ensaio (ver quadro no documento original) SECÇÃO I Aplicação do esquema de ensaio