Decreto-Lei n.º 157/2000

Caso não se disponha de um alimento para animais branco de tipo similar ao da amostra (v. 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de amprolium semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção:

Coluna para cromatografia líquida (4.1.1): 125 mm x 4 mm e enchimento de permuta catiónica Nucleosil 10 SA com granulometria de 10 (mi)m, ou equivalente;

Fase móvel (3.6): mistura 450 + 450 + 100 (v + v + v) de acetonitrilo (3.2), solução de di-hidrogenofosfato de sódio (3.4) e solução de perclorato de sódio (3.5);

Fluxo: 0,7 ml - 1 ml/minuto;

Comprimento de onda de detecção: 264 nm;

Volume injectado: 100 (mi)l.

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.7.3) com 1,0 (mi)g/ml até se obterem alturas de pico e tempos de retenção constantes;

Daí deve resultar unicamente um aumento da altura do pico do amprolium, contabilizadas a quantidade adicionada e a diluição do extracto. A largura do pico a meia altura não poderá diferir mais de 10% da largura inicial do pico do amprolium do extracto da amostra sem adição;

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não terá sido confirmada;

Para teores de amprolium compreendidos entre 25 mg/kg e 500 mg/kg: 15% do maior dos valores;

Para teores de amprolium compreendidos entre 500 mg/kg e 1000 mg/kg: 75 mg/kg;

Para teores de amprolium superiores a 1000 mg/kg: 7,5% do maior dos valores;

2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-,4,5-di-hidro-3,5-dioxo-1,2,4-triacina-2(3H)-il)be nzeno acetonitrilo

Caso não se disponha de um alimento para animais branco de tipo similar ao da amostra (v. 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra a analisar uma quantidade de diclazuril semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção;

Transferir uma alíquota de 10000/p ml e («p» é o teor nominal, em miligramas por quilograma, de diclazuril na pré-mistura) do líquido sobrenadante para um balão de vidro de fundo redondo de volume adequado. Evaporar a 60ºC sob pressão reduzida, num evaporador rotativo (4.3), suspendendo a operação logo que seja atingida a secura. Redissolver o resíduo em 10,0 ml de DMF (3.6), adicionar 15,0 ml de água (3.1) e homogeneizar. Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.3);

Coluna para cromatografia líquida (4.2.1): 100 mm x 4,6 mm e enchimento Hypersil ODS com granulometria de 3 (mi)m, ou equivalente;

Fase móvel:

Eluente A (3.13.1): solução aquosa de acetato de amónio e hidrogenossulfato de tetrabutilamónio;

Eluente B (3.13.2): acetonitrilo;

Eluente C (3.13.3): metanol;

Modo de eluição:

Gradiente linear;

Condições iniciais: a + b + c = 60 + 20 + 20 (v + v + v);

Após dez minutos, aplicação de um gradiente de eluição por forma a atingir a + b + c = 45 + 20 + 35 (v + v + v) ao fim de trinta minutos;

Lavagem com B durante dez minutos;

Fluxo 1,5-2 ml/minuto;

Volume injectado - 20 (mi)l;

Comprimento de onda de detecção - 280 nm.

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução de calibração (3.10), de concentração 2,0 (mi)g/ml até se obterem alturas de pico e tempos de retenção constantes;

w = [((h(índice d,s) x h(índice i,c))/(h(índice i,s) x h(índice d,c))) x ((beta)(índice d,c) 10V)/m)][mg/kg]

em que:

h(índice d,s) = altura ou área do pico do diclazuril da solução da amostra (5.2.1);

h(índice i,s) = altura ou área do pico do padrão interno da solução da amostra (5.2.1);

h(índice d,c) = altura ou área do pico do diclazuril da solução de calibração (3.10);

h(índice i,c) = altura ou área do pico do padrão interno da solução de calibração, (3.10);

(beta)(índice d,c) = concentração de diclazuril, em microgramas por mililitro, da solução de calibração (3.10);

m = massa, em grama, da toma analisada;

V = volume, em mililitros, do extracto da amostra, de acordo com 5.2.1 (isto é, 2,5 ml).

w = [((h(índice d,s) x h(índice i,c))/(h(índice i,s)h(índice d,c))) x ((beta)(índice d,c) 0,02V x p)/m)][mg/kg]

em que:

h(índice d,c) = altura ou área do pico do diclazuril da solução de calibração (3.10);

h(índice i,c) = altura ou área do pico do padrão interno da solução de calibração (3.10);

h(índice d,s) = altura ou área do pico do diclazuril da solução da amostra (5.2.2);

h(índice i,s) = altura ou área do pico do padrão interno da solução da amostra (5.2.2);

(beta)(índice d,c) = concentração de diclazuril da solução de calibração (3.10):

m = massa, em grama, da toma analisada;

V = volume do extracto da amostra, de acordo com 5.2. (isto é, 25 ml).

p = teor nominal, em miligramas por quilograma, de diclazuril da pré-mistura.

Daí deve resultar unicamente um aumento da altura do pico do diclazuril e do pico do padrão interno, contabilizadas a quantidade adicionada e a diluição do extracto. A largura a meia altura desses picos não poderá diferir mais de 10% da largura inicial do pico do diclazuril e do pico do padrão interno, respectivamente, do extracto da amostra sem adição;

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não terá sido confirmada;

Para teores de diclazuril compreendidos entre 0,5 mg/kg e 2,5 mg/kg: 30% do maior dos valores;

Para teores de diclazuril compreendidos entre 2,5 mg/kg e 5 mg/kg: 0,75 mg/kg;

Para teores de diclazuril superiores a 5 mg/kg: 15% do maior dos valores.

Nota. - Para a determinação de teores de carbadox inferiores a 10 mg/kg em alimentos para animais, preparar soluções de calibração com concentração inferior a 2,0 (mi)g/ml.

Nota. - Também pode utilizar-se uma coluna de vidro com torneira ou uma coluna de vidro com uma das extremidades afunilada; neste caso, inserir um tampão de fibra de vidro com uma vareta de vidro e comprimir contra o fundo.

Caso não se disponha de um alimento para animais branco de tipo similar ao da amostra (v. 5.1.1), pode determinar-se a recuperação pelo método da adição de padrão. Nesse caso, adiciona-se à amostra uma quantidade de carbadox semelhante à que já se encontra presente e analisa-se a amostra assim obtida juntamente com a amostra sem adição. A recuperação é calculada por subtracção;

Pipetar uma alíquota do filtrado para um balão aferido de 50 ml. Adicionar 15,0 ml de água, completar o volume com a mistura de metanol e acetonitrilo (3.5) até ao traço e homogeneizar. A concentração de carbadox na solução final deve ser próxima de 10 (mi)g/ml. Filtrar uma alíquota com um filtro de 0,45 (mi)m (4.6). Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.4);

Diluir uma alíquota do filtrado com a mistura de água, metanol e acetonitrilo (3.12) de modo a obter uma concentração final de carbadox de 10 (mi)g/ml-15 (mi)g/ml (para uma preparação a 10%, o factor de diluição é 10). Filtrar uma alíquota com um filtro de 0,45 (mi)m (4.6). Efectuar em seguida a determinação por HPLC (5.4);

Coluna para cromatografia líquida (4.4.1) - 300 mm x 4 mm e enchimento C18 com granulometria de 10 (mi)m, ou equivalente;

Fase móvel (3.10) - mistura 825 + 175 (v + v) de tampão acetato (3.9) e acetonitrilo (3.2);

Fluxo - 1,5-2 ml/minuto;

Comprimento de onda de detecção - 365 nm;

Volume injectado - 20 (mi)l.

Para verificar a estabilidade do sistema cromatográfico, injectar várias vezes a solução padrão de trabalho (3.11.2) com 5,0 (mi)g/ml até se obterem alturas ou áreas de pico e tempos de retenção constantes;

W = [((beta) x V(índice 1))/m] [mg/kg]

em que:

(beta) = concentração de carbadox, em microgramas por mililitro, do extracto da amostra (5.3.2);

V(índice 1) = volume de extracção, em mililitros (isto é, 50 ml);

m = massa, em gramas, da toma analisada;

W = [((beta) x V(índice 2) x f)/m] [mg/kg]

em que:

(beta) = concentração de carbadox, em microgramas/mililitro, do extracto da amostra (5.2.2 ou 5.2.3);

V(índice 2) = volume de extracção, em mililitros (isto é, 50 ml no caso das pré-misturas e 150 ml no caso das preparações);

f = factor de diluição de acordo com 5.2.2 (pré-misturas) ou 5.2.3 (preparações);

m = massa, em gramas, da toma analisada;

Se algum destes critérios não for satisfeito, a presença do analito não terá sido confirmada;