As normas da Portaria n.º 575/93, de 4 de Junho, são aplicáveis, em especial, aos controlos na origem, à organização e ao seguimento dos controlos a efectuar pelo país de destino e às medidas de salvaguarda a aplicar.
ANEXO A
I - Efectivo bovino oficialmente indemne de tuberculose
1 - Um efectivo bovino é oficialmente indemne de tuberculose se:
a) Todos os animais estiverem isentos de sinais clínicos de tuberculose;
b) Todos os animais com mais de seis semanas de idade tiverem reagido negativamente a, pelo menos, duas provas oficiais intradérmicas de tuberculina realizadas em conformidade com o anexo C, a primeira seis meses após a eliminação de qualquer infecção do efectivo e a segunda seis meses mais tarde; no caso de o efectivo ter sido constituído unicamente com animais provenientes de efectivos oficialmente indemnes de tuberculose, sendo a primeira prova realizada, pelo menos, 60 dias após a constituição do efectivo bovino e não sendo a segunda obrigatória;
c) Após a realização da primeira prova referida na alínea b) não tiver sido introduzido no efectivo qualquer bovino com mais de seis semanas, a não ser que tenha reagido negativamente a uma prova intradérmica de tuberculina realizada e avaliada em conformidade com o anexo C e efectuada quer nos 30 dias antes quer nos 30 dias depois da data da sua introdução no efectivo.
Esta prova não é obrigatória em regiões em que a percentagem de efectivos bovinos infectados com tuberculose seja inferior a 0,2% ou se os animais forem originários de um efectivo oficialmente indemne de tuberculose.
2 - Um efectivo bovino conservará o estatuto de oficialmente indemne de tuberculose se:
a) Continuarem a ser satisfeitas as condições das alíneas a) e c) do n.º 1;
b) Todos os animais que entrarem na exploração forem provenientes de efectivos com estatuto de oficialmente indemnes de tuberculose;
c) Todos os animais de exploração, excluindo os vitelos com menos de seis semanas que tiverem nascido na exploração, forem sujeitos a uma prova de tuberculina de rotina, realizada anualmente, em conformidade com o anexo C.
No entanto, de acordo com o procedimento comunitariamente previsto e relativamente a uma região onde todos os efectivos bovinos sejam sujeitos a medidas oficiais para combater a tuberculose, poder-se-á decidir alterar a frequência das provas de rotina do seguinte modo:
- Se a percentagem de efectivos bovinos infectados com tuberculose não for superior a 1%, em média, durante os dois períodos de vigilância bienais mais recentes, o intervalo entre as provas de rotina do efectivo pode ser aumentado para dois anos;
- Se a percentagem de efectivos bovinos infectados com tuberculose não for superior a 0,2%, em média, durante os dois períodos de vigilância bienais mais recentes, o intervalo entre as provas de rotina pode ser aumentado para três anos;
- Se a percentagem de efectivos bovinos infectados com tuberculose não for superior a 0,1%, em média, durante os dois períodos de vigilância trienais mais recentes, o intervalo entre as provas de rotina pode ser aumentado para quatro anos e ou a idade em que os animais têm de ser submetidos a estas provas pode passar para 24 meses.
Pode, igualmente, de acordo com o comunitariamente previsto, ser decidido aumentar a frequência das provas de tuberculina de rotina, caso o nível de incidência da doença aumente.
Se se dispuser de um sistema de identificação e de registo dos bovinos que permita identificar os efectivos de origem e de trânsito e se a percentagem de efectivos infectados não for superior a 0,1%, em média, durante os dois períodos de controlo mais recentes, poderá renunciar-se às provas de tuberculina anuais a realizar aos efectivos, na condição de que:
1) Antes da sua introdução num efectivo, todos os bovinos sejam sujeitos com resultados negativos a uma prova intradérmica de tuberculina;
2) Todos os bovinos abatidos sejam sujeitos a uma pesquisa de lesões de tuberculose, sendo estas sujeitas a um exame bacteriológico para pôr em evidência o bacilo da tuberculose.
3 - O estatuto de oficialmente indemne de tuberculose de um efectivo será suspenso se:
a) As condições referidas no n.º 2 não forem respeitadas;
b) Se considerar que um animal reagiu positivamente a uma prova de tuberculina de rotina ou se tiver sido diagnosticado um caso de tuberculose numa inspecção de rotina post mortem. Nestes casos, o estatuto permanecerá suspenso até que todos os animais restantes com mais de seis semanas de idade tenham reagido negativamente a, pelo menos, duas provas oficiais intradérmicas de tuberculina, em conformidade com o anexo C, sendo a primeira realizada, pelo menos, dois meses após a eliminação do animal da exploração e a segunda, pelo menos, 42 dias após a primeira. No entanto, por derrogação, se após uma prova de rotina efectuada a um efectivo, um ou mais animais tiverem reagido positivamente a uma prova de tuberculina, e se se afigurar que a tuberculose bovina poderá não estar na origem desta reacção, o caso ou os casos suspeitos de tuberculose devem ser plenamente investigados, incluindo nomeadamente a localização e os controlos do efectivo de residência no momento da prova e de qualquer efectivo anterior considerado necessário pela autoridade competente, bem como todas as análises laboratoriais e exames post mortem adequados. Durante a realização destas análises ou exames, o estatuto de oficialmente indemne da tuberculose dos efectivos supra fica suspenso até que os exames clínicos e laboratoriais ou as provas de tuberculina tenham infirmado a presença de tuberculose bovina. No caso de não se confirmar a presença de tuberculose, o estatuto do(s) efectivo(s) poderá ser restabelecido. No entanto, se a prova de rotina efectuada ao efectivo referida na alínea c) do n.º 2 não tiver sido realizada a tempo, o estatuto do efectivo não deve ser suspenso desde que a prova não seja efectuada depois de 60 dias após a data inicialmente prevista e que as provas subsequentes sejam efectuadas dentro do calendário inicialmente fixado;
c) O efectivo contiver animais de estatuto determinado nos termos do n.º 32 do anexo C. Neste caso, o estatuto do efectivo permanecerá suspenso até que tenha sido clarificado o estatuto dos animais.
4 - Uma região pode ser declarada oficialmente indemne de tuberculose, de acordo com o procedimento previsto comunitariamente, se satisfizer as seguintes condições:
a) A percentagem de efectivos bovinos infectados não ser superior a 0,01% durante seis anos consecutivos e, pelo menos, 99,9% dos efectivos terem sido declarados oficialmente indemnes de tuberculose há 10 anos;
b) Existir um sistema de identificação que permita determinar quais os efectivos de origem e de trânsito de cada bovino;
c) Todos os bovinos abatidos serem sujeitos a uma inspecção post mortem por um veterinário oficial;
d) Todos os casos suspeitos de tuberculose serem plenamente investigados, incluindo a localização e o controlo de quaisquer efectivos de origem ou de trânsito e a realização de todos os exames laboratoriais adequados. Durante a realização das análises, o estatuto de oficialmente indemne de tuberculose dos efectivos de origem ou de trânsito fica suspenso até que as análises clínicas ou laboratoriais ou as provas de tuberculina tenham infirmado a presença de tuberculose bovina.
5 - Uma região conservará o estatuto de oficialmente indemne de tuberculose se:
a) Continuarem a ser aplicadas as condições das alíneas a) a d) do n.º 4;
b) Quando confirmado um caso de tuberculose, for retirado o estatuto de oficialmente indemne de tuberculose do efectivo de origem e de trânsito;
c) O estatuto de oficialmente indemne de tuberculose dos efectivos em que tiver sido confirmada a tuberculose continuar suspenso até:
- Ao abate de todos os animais considerados infectados;
- À desinfecção das instalações e dos utensílios;
- Que todos os bovinos restantes com mais de seis semanas de idade tenham reagido negativamente a, pelo menos, duas provas intradérmicas oficiais, realizadas em conformidade com o anexo C, a primeira, pelo menos, seis meses após a retirada do animal infectado e a segunda seis meses depois da primeira.
6 - Caso existam indícios de uma mudança significativa da situação no que se refere à tuberculose numa região que tenha sido considerada oficialmente indemne de tuberculose, pode ser decidido, de acordo com o procedimento previsto comunitariamente, tomar uma decisão de suspensão ou de revogação do estatuto e exigir provas de tuberculina de rotina, a realizar em conformidade com um dos programas da alínea c) do n.º 2.
II - Efectivo bovino indemne de brucelose e oficialmente indemne de brucelose
Para efeitos da presente secção, entende-se por bovinos todos os bovinos, com excepção dos machos castrados com menos de quatro meses.
1 - Um efectivo bovino é oficialmente indemne de brucelose se:
a) Não incluir bovinos vacinados contra a brucelose, excluindo as fêmeas vacinadas há, pelo menos, três anos;
b) Todos os bovinos estiverem isentos de sinais clínicos de brucelose há, pelo menos, seis meses;
c) Todos os bovinos com mais de 12 meses de idade tiverem sido sujeitos a um dos seguintes programas de provas, com resultados negativos, em conformidade com o anexo D:
i) Duas provas de seroaglutinação, a efectuar com intervalos superiores a 3 meses e inferiores a 12 meses;
ii) Três provas do anel, com intervalos de três meses, seguidas de uma prova de seroaglutinação, a efectuar, pelo menos, seis semanas depois;
iii) Duas provas de antigénico brucélico tamponado, a efectuar com intervalos superiores a 3 meses e inferiores a 12 meses;
iv) Duas provas de microaglutinação, a efectuar com intervalos superiores a 3 meses e inferiores a 12 meses.
2 - Um efectivo bovino conservará o estatuto de oficialmente indemne de brucelose se:
a) For realizado anualmente, com resultados negativos, em conformidade com o anexo D, um dos seguintes programas de provas:
i) Três provas do anel realizadas com intervalos de, pelo menos, três meses;
ii) Três provas Elisa do leite realizadas com intervalos de, pelo menos, três meses;
iii) Três provas do anel realizadas com um intervalo de, pelo menos, três meses, seguidas de uma prova sorológica realizada, pelo menos, seis semanas depois;
iv) Duas provas Elisa do leite realizadas com um intervalo de, pelo menos, três meses, seguidas de uma prova sorológica realizada, pelo menos, seis semanas depois;
v) Duas provas sorológicas realizadas com um intervalo de, pelo menos, três meses e não superior a seis meses.
De acordo com o comunitariamente previsto pode uma região não oficialmente indemne de brucelose mas em que todos os efectivos bovinos estejam sujeitos a operações oficiais de combate à brucelose alterar a frequência das provas de rotina do seguinte modo:
- Se a percentagem de efectivos bovinos infectados não for superior a 1%, pode ser suficiente realizar, anualmente, duas provas do anel ou duas provas Elisa do leite com um intervalo de, pelo menos, três meses ou uma prova sorológica;
- Se, pelo menos, 99,8% dos efectivos bovinos tiverem sido declarados oficialmente indemnes de brucelose durante, pelo menos, quatro anos, o intervalo entre os controlos pode ser alargado para dois anos e os controlos devem ser realizados utilizando uma das provas sorológicas referidas na alínea a) do n.º 7.
b) Todos os bovinos que entrarem no efectivo forem provenientes de efectivos com o estatuto de oficialmente indemne de brucelose e, no caso dos bovinos com mais de 12 meses de idade, apresentarem uma contagem brucélica inferior a 30 UI de aglutinação por mililitro, aquando da realização de uma prova de seroaglutinação em conformidade com o anexo D, durante os 30 dias anteriores à introdução no efectivo.
No entanto, a prova de seroaglutinação descrita na alínea b) pode não ser exigida nas regiões em que desde há, pelo menos, dois anos a percentagem de efectivos bovinos infectados com brucelose não seja superior a 0,2% e se os animais forem provenientes de um efectivo oficialmente indemne de brucelose nessas regiões e não tiverem estado em contacto durante o transporte com bovinos de estatuto inferior.
c) Em derrogação da alínea b), os bovinos provenientes de um efectivo bovino indemne de brucelose podem ser introduzidos num efectivo oficialmente indemne de brucelose se tiverem, pelo menos, 18 meses de idade e, no caso de terem sido vacinados contra a brucelose, a vacina tiver sido efectuada há mais de um ano.
Esses animais devem ter apresentado, nos 30 dias anteriores à introdução no efectivo, uma contagem brucélica inferior a 30 UI de aglutinação por mililitro e um resultado negativo numa prova de fixação do complemento, ambas realizadas em conformidade com o anexo D.
No entanto, se um animal proveniente de um efectivo indemne de brucelose for introduzido num efectivo bovino oficialmente indemne de brucelose nos termos destas disposições, esse efectivo deve ser considerado indemne de brucelose durante dois anos a contar da data de introdução do animal.
3 - O estatuto de um efectivo oficialmente indemne de brucelose poderá ser suspenso ou retirado se:
a) As condições referidas nos n.os 1 e 2 não forem respeitadas; ou
b) Na sequência de provas laboratoriais ou por motivos clínicos se suspeitar que um ou mais bovinos têm brucelose.
Caso se suspeite da presença da brucelose num ou mais bovinos de um efectivo oficialmente indemne de brucelose, o estatuto do efectivo pode ser suspenso, e não retirado, se o animal ou animais forem imediatamente abatidos ou isolados.
Se o animal tiver sido abatido, a suspensão pode ser levantada caso duas provas de seroaglutinação, realizadas em conformidade com o anexo C, em todos os bovinos do efectivo com mais de 12 meses de idade, apresentem uma contagem brucélica inferior a 30 UI de aglutinação por mililitro. A primeira prova deve ser realizada, pelo menos, 30 dias após o abate do animal e a segunda, pelo menos, 60 dias mais tarde.
Se o animal tiver sido isolado, pode proceder-se à sua reintrodução no efectivo, e o estatuto deste último pode ser restabelecido se o animal posteriormente apresentar uma contagem de seroaglutinação inferior a 30 UI de aglutinação por mililitro e se se tiver obtido um resultado negativo numa prova de fixação do complemento, sendo estas provas realizadas em conformidade com o anexo D.
Se na sequência de provas laboratoriais ou de análises epidemiológicas for confirmada num efectivo uma infecção com brucela, o estatuto desse efectivo só poderá ser restabelecido quando todas as fêmeas prenhes no momento da primeira manifestação da doença apresentarem resultados negativos nas provas supracitadas, sendo a prova final realizada, pelo menos, 21 dias após aparição.
4 - Um efectivo bovino é indemne de brucelose se satisfizer as condições das alíneas a), b) e c) do n.º 1, com as seguintes excepções:
i) As fêmeas podem ser vacinadas:
- Antes dos seis meses de idade com uma estirpe 19 da vacina viva ou com outras vacinas aprovadas comunitariamente; ou
- Antes dos 15 meses de idade com uma vacina inactivada 45/20 adjuvante, inspeccionada e reconhecida oficialmente;
ii) Os bovinos com menos de 30 meses que tenham sido vacinados com uma estirpe 19 da vacina viva podem apresentar um resultado na prova de seroaglutinação superior a 30 UI, mas inferior a 80 UI de aglutinação por mililitro desde que na prova de fixação do complemento dêem um resultado inferior a 30 unidades CEE no caso das fêmeas vacinadas há menos de 12 meses ou inferior a 20 unidades CEE nos restantes casos;
iii) Para além das provas enumeradas na alínea c) do n.º 1, devem ser igualmente aprovados os seguintes programas de provas para obter o estatuto de indemne de brucelose:
a) Duas provas de antigénio brucélico tamponado realizadas com um intervalo superior a 3 meses e inferior a 12 meses;
b) Duas provas de microaglutinação realizadas com um intervalo superior a 3 meses e inferior a 12 meses, efectuadas nos termos do anexo D.
5 - Um efectivo bovino conservará o estatuto de indemne de brucelose se:
i) For objecto de um dos programas de provas enumerados na alínea a) do n.º 2;
ii) Os bovinos que entram no efectivo respeitarem as condições da alínea b) do n.º 2; ou:
- Forem provenientes de efectivos com o estatuto de indemnes de brucelose e, no caso dos bovinos com mais de 12 meses de idade, apresentarem, nos 30 dias anteriores à introdução no efectivo, menos de 30 UI de aglutinação por mililitro numa prova de seroaglutinação e uma prova negativa de fixação do complemento, em conformidade com o anexo D; ou
- Forem provenientes de efectivos com o estatuto de indemne de brucelose, a sua idade for inferior a 30 meses e tiverem sido vacinados com uma estirpe 19 da vacina viva, podendo numa prova de seroaglutinação apresentar um resultado superior a 30 UI mas inferior a 80 UI de aglutinação por mililitro desde que na prova de fixação do complemento dêem um resultado inferior a 30 unidades CEE no caso das fêmeas vacinadas há menos de 12 meses ou inferior a 20 unidades CEE nos restantes casos.
6 - O estatuto de indemne de brucelose de um efectivo será suspenso ou revogado se:
a) As condições definidas nos n.os 4 e 5 supra não forem respeitadas; ou
b) Na sequência de provas laboratoriais ou por motivos clínicos, existirem suspeitas de presença de brucelose em animais com idade superior a 30 meses.
Se se suspeitar que um ou mais animais com idade superior a 30 meses, num efectivo indemne de brucelose, estão infectados com brucela, o estatuto do efectivo pode ser suspenso, e não retirado, caso o animal ou animais sejam imediatamente destruídos ou isolados.
Se o animal tiver sido destruído, a suspensão pode ser levantada caso duas provas de seroaglutinação realizadas em conformidade com o anexo D, em todos os bovinos do efectivo com mais de 12 meses de idade, apresentem uma contagem inferior a 30 UI de aglutinação por mililitro. A primeira prova deve ser realizada, pelo menos, 30 dias após a retirada do animal e a segunda, pelo menos, 60 dias depois.
Caso o animal tenha sido isolado, pode-se proceder à sua reintrodução no efectivo, e o estatuto deste último poderá ser restabelecido se, posteriormente, o animal apresentar numa prova de seroaglutinação uma contagem inferior a 30 UI de aglutinação por mililitro e tiver dado um resultado negativo numa prova de fixação do complemento, sendo estas provas realizadas nos termos do anexo D.
Se, na sequência de provas laboratoriais ou de pesquisas epidemiológicas, for confirmada num efectivo uma infecção com brucela, o estatuto desse efectivo só será restabelecido quando todas as fêmeas prenhes no momento do surgimento do foco apresentarem resultados negativos nas provas supracitadas, sendo a prova final realizada, pelo menos, 21 dias após a parição.
7 - O território nacional ou uma região pode ser declarado oficialmente indemne de brucelose de acordo com o procedimento comunitariamente previsto se satisfizer as seguintes condições:
a) Não ter sido registado durante, pelo menos, três anos qualquer caso de aborto devido a infecção com brucela e, pelo menos, 99,8% do efectivo ter sido declarado oficialmente indemne de brucelose desde há 10 anos;
b) Existir um sistema de identificação que possibilite a identificação dos efectivos de origem e de trânsito relativamente a cada bovino.
8 - Sem prejuízo do n.º 9, uma região declarada oficialmente indemne de brucelose manterá este estatuto se todos os bovinos com mais de 24 meses de idade forem sujeitos quer a duas provas do anel quer a uma prova sorológica todos os três anos. Caso se observe um resultado positivo, serão aplicadas as condições do n.º 6.
9 - Uma região declarada oficialmente indemne de brucelose notificará todas as ocorrências de casos de brucelose. De acordo com o procedimento comunitariamente previsto pode ser proposta a suspensão ou revogação do estatuto e exigir-se a pesquisa sistemática de brucelose, a realizar em conformidade com os programas do n.º 2.
10 - O território nacional pode ser declarado oficialmente indemne de brucelose de acordo com o procedimento comunitariamente previsto se satisfizer as seguintes condições:
a) Não ter sido registado qualquer aborto devido a infecção com brucela, pelo menos, nos últimos três anos e, pelo menos, 99,8% das explorações terem sido declaradas oficialmente indemnes de brucelose desde há 10 anos;
b) Existir um sistema de identificação que permita determinar quais os efectivos de origem e de trânsito de cada bovino.
11 - O território nacional conservará o estatuto de oficialmente indemne de brucelose se:
- Forem notificados à autoridade competente todos os casos de bovinos suspeitos de estar infectados com brucela, sendo esses animais submetidos a investigação oficial relativamente à brucelose, a qual compreenderá, pelo menos, duas provas sorológicas de sangue, incluindo uma prova de fixação do complemento, bem como um exame microbiológico de amostras adequadas colhidas, no caso de aborto;
- Durante o período de suspeita, que se manterá até à obtenção de resultados negativos nas provas previstas no primeiro travessão, tiver sido suspenso o estatuto de oficialmente indemne de brucelose do efectivo de origem ou de trânsito do bovino suspeito;
- Em caso de obtenção de um resultado positivo, aplicar-se-ão as condições do n.º 6.
12 - De acordo com o procedimento comunitariamente previsto, o estatuto poderá ser suspenso ou retirado e ser exigida a realização de provas de rotina para a brucelose efectuadas de acordo com uma das disposições do n.º 1.
13 - a) Para efeitos da presente secção, entende-se por prova sorológica uma prova de seroaglutinação, uma prova de antigénio brucélico tamponado, uma prova de fixação do complemento, uma prova de plasmoaglutinação, uma prova do anel em plasma, uma prova de microaglutinação ou uma prova Elisa individual em sangue, como descrito no anexo D.
b) Quando são efectuadas provas do anel em cisternas de leite, o número dessas provas referido no presente anexo deve ser duplicado e os intervalos entre as provas devem ser reduzidos para metade.
ANEXO B
Normas de fabrico e utilização de tuberculinas bovinas e aviárias
1 - As provas de tuberculina controladas oficialmente devem ser realizadas com tuberculinas PPD ou HCSM.
2 - Os padrões a utilizar pelos fabricantes no controlo das tuberculinas bovinas PPD e HCSM devem ser aferidos em unidades comunitárias de tuberculina (UCT), com base em ensaios biológicos com a tuberculina padrão comunitária apropriada.
3 - Os padrões a utilizar pelos fabricantes para o controlo das tuberculinas aviárias devem ser aferidos em unidades internacionais, com base em ensaios biológicos efectuados com o padrão comunitário de PPD de tuberculina aviária.
4 - O padrão comunitário PPD de tuberculina bovina é o do Institut voor Dierhonderij en Diergesondheid (ID-DLO), Lelystad, Países Baixos.
5 - O padrão comunitário de HCSM de tuberculina bovina é o do Institut Pasteur, Paris, França.
6 - O padrão comunitário de tuberculina aviária é o do Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Inglaterra.
7 - As tuberculinas bovinas devem ser preparadas com uma das seguintes estirpes de Mycobacterium bovis:
a) AN 5;
b) Vallee.
8 - As tuberculinas aviárias devem ser preparadas com uma das seguintes estirpes de Mycobacterium avium:
a) D 4 ER;
b) TB 56.
9 - O pH das tuberculinas deve situar-se entre 6,5 e 7,5.
10 - É necessário confirmar, de modo que satisfaça o organismo público responsável pelo controlo oficial da tuberculina, que os agentes conservantes especificamente antimicrobianos ou outras substâncias que possam ter sido adicionadas à tuberculina não alteram nem a inocuidade nem a eficácia do produto.
As concentrações máximas autorizadas para o fenol e o glicerol são as seguintes:
a) Fenol - 0,5% M/v;
b) Glicerol - 10% v/v.
11 - Desde que sejam conservadas ao abrigo da luz e a uma temperatura entre 2ºC e 8ºC, as tuberculinas podem ser utilizadas até ao fim dos períodos abaixo indicados a contar do último ensaio de actividade considerado satisfatório:
a) Tuberculinas líquidas PPD - dois anos;
b) Tuberculinas liofilizadas PPD - oito anos;
c) Tuberculinas HCSM diluídas - dois anos.
12 - É encarregue do controlo oficial das tuberculinas o Laboratório Nacional de Investigação Veterinária.
13 - Deve ser efectuado um controlo oficial de cada um dos lotes de tuberculinas engarrafadas e prontas a serem utilizadas.
14 - O controlo das tuberculinas deve ser efectuado por métodos biológicos e por métodos químicos.
15 - As tuberculinas devem ser estéreis. Os ensaios de esterilidade devem ser efectuados de acordo com as regras da farmacopeia europeia.
16 - Deve ser realizado um controlo para confirmar a inexistência de toxicidade ou de propriedades irritantes de acordo com as regras da farmacopeia europeia.
17 - As tuberculinas devem ser submetidas a uma análise química que permita determinar a concentração de glicerol e ou de fenol, assim como a concentração de qualquer outro agente conservante que possa ter sido adicionado.
18 - Deve ser realizada uma prova de não sensibilização à tuberculina de acordo com as regras da farmacopeia europeia.
19 - A actividade das tuberculinas deve ser avaliada por métodos biológicos. Estes métodos, que devem ser utilizados para as tuberculinas HCSM e PPD, baseiam-se numa comparação entre as tuberculinas padrão e as tuberculinas a ensaiar.
20 - O teor de proteína da tuberculina PPD deve ser avaliado pelo método do Kjeldahl. O factor de conversão do azoto em tubérculo-proteína é de 6,25.
21 - O padrão comunitário da tuberculina bovina HCSM tem uma actividade de 65000 unidades comunitárias de tuberculina (UCT) por mililitro e é apresentada em ampolas de 5 ml.
22 - O padrão comunitário da tuberculina bovina PPD tem uma actividade de 50000 unidades comunitárias de tuberculina (UCT) por miligrama de PPD e é apresentada no estado liofilizado, em ampolas contendo 1,8 mg de PPD, o que significa que 0,00002 mg de PPD têm uma actividade igual a uma unidade comunitária de tuberculina.
23 - O padrão comunitário da tuberculina aviária PPD tem uma actividade de 50000 unidades internacionais (UI) por miligrama de matéria seca do derivado proteico purificado e é apresentado no estado liofilizado, em ampolas contendo 10 mg de PPD e 26,3 mg de sais, o que significa que 0,000072 6 mg de padrão têm uma actividade igual a uma unidade internacional.
24 - As tuberculinas submetidas pelos fabricantes ao controlo dos organismos oficiais referidos no n.º 12 devem, em primeiro lugar, ter sido testadas para determinação da actividade por ensaio biológico efectuado por comparação com os padrões apropriados indicados nos n.os 2 e 3.
25 - a) Controlo da actividade em cobaias - devem usar-se cobaias albinas de peso compreendido entre 400 g e 600 g. Estas cobaias devem estar de boa saúde no momento da injecção da tuberculina. Em cada ensaio devem ser utilizadas, pelo menos, oito cobaias. O ensaio não deve ser realizado menos de um mês após a sensibilização.
aa) Para ensaiar as tuberculinas bovinas, as cobaias serão sensibilizadas de acordo com um dos seguintes métodos:
1) Injecção de Mycobacterium bovis da estirpe AN5, morta pelo calor, em adjuvante oleoso;
2) Injecção de Mycobacterium bovis da estirpe AN5, viva, em soro fisiológico;
3) Injecção de vacina BCG.
ab) Para testar as tuberculinas aviárias, a sensibilização das cobaias deve fazer-se por injecção de 2 mg de bacilos tuberculosos do tipo aviário, mortos pelo calor, em suspensão de cerca de 0,5 ml de parafina líquida estéril ou por injecção de bacilos tuberculosos vivos do tipo aviário em soro fisiológico. Para esse efeito, deve utilizar-se uma estirpe do tipo aviário D4.
ac) Cada tuberculina a controlar deve ser avaliada por comparação com a tuberculina padrão apropriada, por injecção intradérmica em grupos de cobaias convenientemente sensibilizadas.
Devem cortar-se os pêlos de ambos os flancos de cada cobaia. O ensaio deve basear-se numa comparação entre as reacções provocadas por uma série de injecções intracutâneas de doses de 0,2 ml, no máximo, de diluições de tuberculina padrão em solução salina isotónica tamponada contendo 0,0005% de Tween 80 e as reacções provocadas por uma série correspondente de injecções da tuberculina a ensaiar. As diluições far-se-ão segundo séries geométricas e serão injectadas nas cobaias segundo um quadrado latino aleatório (quatro casas de cada lado de um ensaio em oito pontos). Os diâmetros das reacções em cada caso devem ser medidos e anotados vinte e quatro a vinte e oito horas depois.
Para cada amostra de tuberculina a ensaiar há que fazer uma estimativa da actividade relativa por comparação com o padrão apropriado e determinar o intervalo de confiança por métodos estatísticos; utilizarão os diâmetros das reacções e os logaritmos das doses como parâmetros. A tuberculina bovina a ensaiar é aceitável se a sua actividade estimada garantir, por dose individual, 2000 unidades comunitárias de tuberculina ((mais ou menos)25%) no gado. A actividade de cada tuberculina deve ser expressa em unidades comunitárias de tuberculina ou em unidades internacionais por mililitro, consoante o caso.
b) Controlo de actividade em bovinos - pode efectuar-se um controlo periódico da actividade das tuberculinas bovinas em animais infectados natural ou artificialmente por tuberculose. Estes controlos de actividade realizados em grupos de bovinos tuberculosos devem incluir uma injecção intradérmica (em quatro ou seis pontos) da tuberculina a ensaiar; sendo feitos por comparação com o padrão adequado, sendo a actividade da tuberculina avaliada por métodos estatísticos como no ensaio realizado em cobaias.
26 - A rotulagem dos recipientes e das embalagens de tuberculina deve satisfazer as condições a seguir indicadas:
O rótulo do recipiente e o rótulo da embalagem devem indicar:
- O nome do preparado;
- Para preparados líquidos, o volume total do recipiente;
- O número de unidades comunitárias ou de unidades internacionais por mililitro ou por miligrama;
- O nome do fabricante;
- O número do lote;
- A natureza e a quantidade do líquido de reconstituição, para os preparados liofilizados;
O rótulo do recipiente ou o rótulo da embalagem devem indicar:
- O prazo de validade;
- As condições de conservação;
- A denominação e, se possível, a proporção de qualquer substância adicionada;
- O tipo de bacilo utilizado para a preparação da tuberculina.
27 - Serão designados laboratórios comunitários de acordo com o procedimento comunitariamente previsto, encarregues do exame complementar das tuberculinas utilizadas normalmente, a fim de garantir que a actividade de cada uma dessas tuberculinas seja apropriada, tendo em conta a tuberculina padrão comunitário adequada. Essas análises deverão ser realizadas em bovinos tuberculosos, em cobaias convenientemente sensibilizadas e por meio de ensaios químicos apropriados.
28 - Consideram-se provas oficiais de tuberculina:
a) A intradermotubelrculinização simples - esta prova exige uma única injecção de tuberculina bovina;
b) A intradermotuberculinização de comparação - esta prova exige uma só injecção de tuberculina bovina e uma só injecção de tuberculina aviária, administradas simultaneamente.
29 - A dose de tuberculina injectada será:
1) 2000 UCT, no mínimo, de tuberculina bovina;
2) 2000 UI, no mínimo, de tuberculina aviária;
3) O volume de cada dose injectada não deverá exceder 0,2 ml.
30 - As provas de tuberculina devem ser realizadas por injecção da ou das tuberculinas na pele do pescoço. Os pontos de injecção situar-se-ão no limite entre os terços anterior e médio do pescoço. Caso sejam injectadas no mesmo animal tuberculinas aviária e bovina, o ponto de injecção da tuberculina aviária deve situar-se a cerca de 10 cm da linha superior do pescoço e o ponto de injecção da tuberculina bovina deve situar-se 12,5 cm abaixo, numa linha mais ou menos paralela à linha da espádua, ou em lados diferentes do pescoço; nos animais jovens, em que ainda não seja possível separar suficientemente os pontos de injecção de um dos lados do pescoço, será aplicada uma injecção de cada lado em sítios idênticos, no centro do terço médio do pescoço.
31 - A técnica de administração da tuberculina e a interpretação das reacções serão as seguintes:
a) Técnica - nas zonas de injecção os pêlos devem ser cortados e a pele limpa. Segura-se uma prega da pele de cada zona em que os pêlos foram cortados, entre o indicador e o polegar, mede-se com uma craveira e anota-se o resultado. Introduz-se obliquamente nas camadas mais profundas da pele uma pequena agulha estéril, com o bordo biselado voltado para o exterior, ligado a uma seringa graduada contendo tuberculina. A seguir injecta-se a dose de tuberculina. Uma injecção bem dada provocará, à palpação, um ligeiro inchaço com as dimensões de uma ervilha em cada ponto de injecção. A espessura da prega de pele em cada ponto de injecção voltará a ser medida e registada setenta e duas horas depois da injecção;
b) Interpretação das reacções - a interpretação das reacções basear-se-á na observação clínica e no aumento ou aumentos registados na espessura da prega da pele nos pontos de injecção setenta e duas horas depois da injecção da ou das tuberculinas:
ba) Reacção negativa - se apenas se observar um inchaço limitado, com um aumento máximo de 2 mm de espessura da prega da pele, sem sinais clínicos, tais como edema difuso ou extenso, exsudado, necrose, dor ou reacção inflamatória dos canais linfáticos da região ou dos gânglios;
bb) Reacção duvidosa - se não se observar nenhum dos sinais clínicos indicados na alínea ba), mas o aumento de espessura da prega da pele for superior a 2 mm e inferior a 4 mm;
bc) Reacção positiva - se se observarem os sinais clínicos indicados na alínea ba) ou um aumento de espessura da prega da pele de 4 mm ou mais no sítio da injecção.
32 - A interpretação das provas oficiais de tuberculina é a seguinte:
a) Intradermotuberculinização simples:
Positiva - reacção tal como definida na alínea bc) do n.º 31;
Duvidosa - reacção idêntica à definida na alínea bb) do n.º 31;
Negativa - reacção tal como definida na alínea ba) do n.º 31.
Os animais em que a intradermotuberculinização simples tenha dado resultados duvidosos serão submetidos a uma outra tuberculinização passado um prazo mínimo de 42 dias.
Os animais em que esta segunda prova não dê resultados negativos devem ser considerados como tendo reagido positivamente à prova de tuberculina.
Os animais com resultados positivos na prova intradérmica simples podem ser submetidos a uma intradermotuberculinização de comparação;
b) Intradermotuberculinização de comparação para a determinação e manutenção do estatuto de efectivo oficialmente indemne de tuberculose:
Positiva - reacção bovina superior em mais de 4 mm à reacção aviária ou presença de sinais clínicos;
Duvidosa - reacção bovina positiva ou duvidosa e superior em 1 mm a 4 mm à reacção aviária e ausência de sinais clínicos;
Negativa - reacção bovina negativa ou reacção bovina positiva ou duvidosa mas igual ou inferior a uma reacção aviária positiva ou duvidosa e ausência de sinais clínicos nos dois casos.
Os animais em que a intradermotuberculinização de comparação tenha dado resultados duvidosos devem ser submetidos a uma outra prova de tuberculina passado um prazo mínimo de 42 dias. Os animais em que esta segunda prova de tuberculina não dê resultados negativos são considerados como tendo reagido positivamente à tuberculina;
c) O estatuto de efectivo oficialmente indemne de tuberculose pode ser suspenso, ficando os animais do efectivo excluídos do comércio intracomunitário até estar regularizado o estatuto dos animais seguintes:
1) Animais considerados como tendo tido uma reacção duvidosa à prova de tuberculina simples;
2) Animais considerados como tendo reagido positivamente à prova de tuberculina simples mas que devem ser submetidos a uma prova de tuberculina de comparação;
3) Animais considerados como tendo tido uma reacção duvidosa à prova de tuberculina de comparação;
d) Nos casos em que a legislação comunitária exija que os animais sejam submetidos a uma prova intradérmica antes da sua deslocação, a prova deve ser interpretada de forma que sejam excluídos do comércio intracomunitário os animais em que o aumento de espessura da prega de pele seja superior a 2 mm ou em que se verifique a presença de sinais clínicos.
ANEXO C
Brucelose
A - Provas de seroaglutinação
1 - O soro padrão de aglutinação deve estar em conformidade com o soro padrão preparado pelo Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Inglaterra.
Uma ampola deve conter 1000 UI de aglutinação obtidas por liofilização de 1 ml de soro de bovino.
2 - O soro padrão deve ser o soro fornecido pelo Bundesgesundheitsamt, Berlim.
3 - O grau de aglutinação de brucela no soro deve ser expresso em unidades internacionais (UI) por mililitro (por exemplo, soro x = 80 UI/ml).
4 - As observações referentes à seroaglutinação lenta em tubos devem ser feitas aos 50% ou 75% de aglutinação, tendo o antigénio utilizado sido titulado em idênticas condições por referência a um soro padrão.
5 - O poder aglutinante de vários antigénios em reacção ao soro padrão deve situar-se dentro dos seguintes limites:
- Se a observação for feita aos 50% - entre 1/600 e 1/1000;
- Se a observação for feita aos 75% - entre 1/500 e 1/750.
6 - Na preparação do antigénio a utilizar na aglutinação em tubo (método lento) deve ser utilizada a estirpe n.º 99 de Weybridge, a estirpe USDA 1119 ou qualquer outra estirpe de sensibilidade equivalente.
7 - Os meios de cultura utilizados para a conservação da estirpe no laboratório e para a produção de antigénio não devem encorajar a dissociação das bactérias (em s e r); deve utilizar-se, de preferência, o ágar de batata.
8 - A emulsão bacteriana deve ser feita a partir de soro fisiológico (NaCl 8,5%) fenolizado a 5%. Não deve ser utilizado formol.
9 - O Laboratório Nacional de Investigação Veterinária é o organismo público responsável pelas provas oficiais dos antigénios.
10 - Os antigénios podem ser fornecidos concentrados, desde que seja indicado no rótulo do frasco o factor de diluição a utilizar.
11 - Para a realização das provas de seroaglutinação devem ser preparadas, pelo menos, três diluições de cada soro. As diluições do soro suspeito devem ser feitas de forma que a leitura referente à reacção no limite de infecção seja feita no tubo médio. Caso haja uma reacção positiva neste tubo, o soro suspeito contém pelo menos 30 UI de aglutinação por mililitro.
B - Prova da reacção de fixação do complemento
1 - O soro padrão é o mesmo que o mencionado no n.º 1 da parte A do presente anexo. Para além do teor mencionado em unidades internacionais de aglutinação, 1 ml deste soro bovino liofilizado deve conter 1000 unidades de sensibilização que fixem o complemento. Estas unidades de sensibilização são designadas por unidades CEE de sensibilização.
2 - O soro padrão deve ser fornecido pelo Bundesgesundheitsamt, Berlim.
3 - O teor de anticorpos fixadores do complemento no soro deve ser expresso em unidades CEE de sensibilização (por exemplo, soro x = 60 unidades CEE de sensibilização por mililitro).
4 - Um soro que contenha 20 ou mais unidades CEE de sensibilização (por exemplo, uma actividade igual a 20(por mil) da do soro padrão) por mililitro deve ser considerado positivo.
5 - Os soros devem ser inactivados do seguinte modo:
a) Soro de bovino - 50ºC a 60ºC a durante trinta a cinquenta minutos;
b) Soro de suíno - 60ºC durante trinta a cinquenta minutos.
6 - Na preparação do antigénio devem ser utilizadas as estirpes n.º 99 de Weybridge ou USDA 1119. O antigénio representa uma suspensão bacteriana em soro fisiológico a 0,85% ou numa solução de carga de Veronal.
7 - Para a realização da prova de reacção dever-se-á utilizar uma dose complementar superior à dose mínima necessária para a hemólise total.
8 - A prova de reacção de fixação do complemento deve ser sempre acompanhada dos seguintes controlos:
a) Controlo do efeito anticomplementar do soro;
b) Controlo do antigénio;
c) Controlo dos corpúsculos vermelhos do sangue sensibilizados;
d) Controlo do complemento;
e) Controlo da sensibilidade no início da reacção, utilizando um soro positivo;
f) Controlo da especificidade da reacção utilizando um soro negativo.
9 - A verificação e o controlo oficial dos soros e antigénios padrão devem ser efectuados pelo Laboratório Nacional de Investigação Veterinária.
10 - Os antigénios podem ser fornecidos concentrados, desde que o factor de diluição a utilizar esteja indicado no rótulo do frasco.
C - Prova do anel
1 - Deve ser submetido à prova do anel o conteúdo de cada batedeira ou de cada cisterna de leite da exploração.
2 - O antigénio padrão a utilizar deve ser proveniente de um instituto comunitariamente definido. Recomenda-se a normalização dos antigénios de acordo com as recomendações da OMS/FAO.
3 - O antigénio só pode ser corado com hematoxilina ou tetrazólio; deve utilizar-se, de preferência, a hematoxilina.
4 - Caso não se tomem medidas de conservação, a prova de reacção deve ser efectuada de dezoito a vinte e quatro horas após a colheita da amostra da vaca. Caso a prova deva ser realizada mais de vinte e quatro horas depois de colhida a amostra de leite, deve utilizar-se um conservante, podendo ser utilizados a formalina ou o cloreto de mercúrio; se for utilizado um destes conservantes, a prova deve ser realizada nos 14 dias seguintes ao da colheita da amostra. A formalina pode ser adicionada ao leite até uma concentração final, na amostra, de 0,2%; nesse caso, a proporção do leite relativamente à solução de formalina deve ser, no mínimo, de 10 para 1. Em vez da formalina, pode ser utilizada uma solução de cloreto de mercúrio, até uma concentração final, no leite, de 0,2%; nesse caso, a relação entre a quantidade de leite e de solução de cloreto de mercúrio deve ser de 10 para 1.
5 - A reacção deve realizar-se segundo um dos seguintes métodos:
- Numa coluna de leite com, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 1 ml, ao qual se adicionaram 0,03 ml de um dos antigénios corados padronizados;
- Numa coluna de leite de, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 1 ml, ao qual se adicionaram 0,05 ml de um dos antigénios corados padronizados;
- Num volume de leite de 8 ml, ao qual se adicionaram 0,08 ml de um dos antigénios corados padronizados;
- Numa coluna de leite de, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 2 ml, ao qual se adicionaram 0,05 ml de um dos antigénios corados padronizados.
6 - A mistura de leite e antigénios deve ser incubada a 37ºC durante um período não inferior a quarenta e cinco minutos e não superior a sessenta minutos. O ensaio deve ser avaliado nos quinze minutos seguintes à retirada do incubador.
7 - A reacção deve ser avaliada de acordo com os seguintes critérios:
a) Reacção negativa - leite corado, nata incolor;
b) Reacção positiva - leite e nata corados da mesma forma, ou leite incolor e nata corada.
D - Prova do antigénio brucélico tamponado
A prova do antigénio brucélico tamponado pode ser realizada por um dos seguintes métodos:
a) Prova manual:
1) O soro padrão deve ser o segundo soro padrão internacional anti-Brucella abortus fornecido pelo Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Inglaterra;
2) O antigénio deve ser preparado sem referência à concentração de células, devendo a sua sensibilidade ser aferida por comparação com o segundo soro padrão internacional anti-Brucella abortus, de forma que o antigénio produza uma reacção positiva com uma diluição do soro de 1:47,5 e uma reacção negativa com uma diluição de 1:55;
3) Deve preparar-se uma suspensão do antigénio em diluente tamponado de antigénio brucélico com pH de 3,65 (mais ou menos)0,5, e pode ser corado com o corante rosa-de-bengala;
4) Na preparação do antigénio deve ser utilizada a estirpe n.º 99 de Weybridge ou USDA 1119 ou ainda qualquer outra estirpe de sensibilidade equivalente;
5) Os meios de cultura utilizados para a conservação da estirpe no laboratório e para a produção de antigénio não devem encorajar a dissociação das bactérias (em s e r); deve utilizar-se meio ágar de batata ou métodos de cultura contínua;
6) O antigénio deve ser controlado por comparação com oito soros conhecidos liofilizados, positivos e negativos;
7) A verificação oficial e o controlo do antigénio e do soro padrão deve ser efectuada pelo Laboratório Nacional de Investigação Veterinária;
8) O antigénio será fornecido pronto a usar;
9) A prova do antigénio brucélico tamponado será realizada da seguinte forma:
a) Colocar uma gota (0,03 ml) de antigénio e uma gota (0,03 ml) de soro, numa placa branca;
b) Misturar as gotas com um agitador, primeiro segundo uma linha recta e depois num movimento circular de cerca de 10 mm a 12 mm de diâmetro;
c) Depois agitar a placa alternadamente para a frente e para trás durante quatro minutos (cerca de 30 movimentos por minuto);
d) As leituras devem ser feitas com boa luz; caso não haja sinais de aglutinação, a prova será considerada negativa; qualquer nível de aglutinação será considerado positivo, salvo se tiver havido uma dessecação excessiva na periferia.
b) Método automatizado - o método automatizado deve ser, pelo menos, tão sensível e preciso como o método manual.
E - Prova do anel em plasma
a) Extracção do plasma - centrifugar a 3000 r/min, durante três minutos, um tubo contendo sangue ao qual se adicionou EDTA para impedir a coagulação; o tubo deve ser depois mantido a 37ºC e durante doze a vinte e quatro horas.
b) Avaliação - introduzir 0,2 ml de plasma estabilizado num tubo contendo 1 ml de leite não tratado. Misturar e adicionar depois uma gota (0,05 ml) de antigénio antibrucélico, tornando a misturar em seguida. O antigénio deve ser padronizado por comparação com um antigénio padrão fornecido pelo Bundesgesundheitsamt, Berlim, Alemanha. Incubar durante quarenta e cinco minutos a 37ºC e fazer uma leitura nos quinze minutos seguintes. O resultado será considerado positivo se o anel se tiver tornado da mesma cor que a coluna de leite ou mais escuro.
F - Aglutinação do plasma
O plasma extraído segundo o método previsto na alínea a) da parte E pode ser utilizado imediatamente após a centrifugação, não sendo necessária a estabilização térmica. Misturar 0,05 ml de plasma com 1 ml de antigénio para uma seroaglutinação de 50%, o que corresponde a uma seroaglutinação na diluição de 1:20. A leitura deve ser feita dezoito a vinte e quatro horas após a incubação a 37ºC. Uma aglutinação de 50% ou mais deve ser considerada positiva.
G - Prova de microaglutinação
1 - Os diluentes são constituídos por solução salina fisiológica a 0,85%, com 0,5% de fenol.
2 - O antigénio deve ser preparado de acordo com a parte A, n.os 6, 7 e 8, do presente anexo e ser titulado tal como descrito na parte A, n.º 5. No momento de utilização do antigénio, adicionar safranina O a 0,02% (diluição final).
3 - O soro padrão é o mesmo que o referido na parte A, n.º 1.
4 - O soro padrão deve ser fornecido pelo Bundesgesundheitsamt, Berlim.
5 - A prova de microaglutinação deve ser realizada em placas com cavidades de fundo cónico, com 0,250 ml de volume. A prova deve ser efectuada do seguinte modo:
a) Pré-diluição do soro - em cada cavidade adicionar 0,050 ml de cada soro a analisar a 0,075 ml de diluente. Agitar as misturas durante trinta segundos;
b) Diluição gradual do soro - preparar pelo menos três diluições de cada soro. Para tal, a partir das pré-diluições (1:2,5) retirar 0,025 ml de cada soro e colocá-los sobre uma placa que contenha 0,025 ml de diluente. Desta forma, a primeira diluição é de 1 para 5, e as seguintes serão diluídas de um factor 2;
c) Adição do antigénio - em cada uma das cavidades contendo as diversas diluições do soro adicionar 0,025 ml de antigénio. Agitar as placas durante trinta segundos e em seguida fechá-las com as respectivas tampas e mantê-las a 37ºC e durante vinte a vinte e quatro horas, em atmosfera humidificada;
d) Leitura dos resultados - a avaliação da sedimentação do antigénio faz-se examinando o fundo da cavidade reflectida num espelho côncavo colocado acima desta. Se a reacção for negativa, o antigénio sedimenta sob a forma de um botão compacto com limite bem definido e de coloração vermelha intensa. Se, pelo contrário, a reacção for positiva, forma-se um véu rosado difuso e uniformemente distribuído. As diversas percentagens de aglutinação são determinadas por comparação com antigénios testemunhas, com 0,25%, 50%, 75% e 100% de aglutinação. O título de cada soro é expresso em unidades internacionais aglutinantes por mililitro. A prova deve incluir testemunhas com soros negativos e positivos, diluídos de forma a conter 30 UI aglutinantes por mililitro.
H - Prova de imunoabsorção enzimática (Elisa) para a pesquisa de brucelose bovina
1 - Os materiais e reagentes a utilizar são os seguintes:
a) Microplacas para fase sólida, tinas ou qualquer outra fase sólida;
b) Antigénio fixado à fase sólida com ou sem a ajuda de anticorpos de captação policlonal ou monoclonal;
c) Fluido biológico a examinar;
d) Controlos positivos e negativos correspondentes;
e) Conjugado;
f) Substrato adaptado ao enzima utilizado;
g) Solução de paragem, se necessário;
h) Soluções para a diluição das amostras a ensaiar, para a preparação dos reagentes e para a lavagem;
i) Sistema de leitura apropriado ao substrato utilizado.
2 - Padronização e sensibilidade da prova:
1) As amostras colectivas de leite examinadas são consideradas negativas se derem uma reacção correspondente a menos de 50% da verificada com uma diluição de 1/10000 do segundo soro padrão internacional de brucelose obtido em leite negativo;
2) As amostras de soro individuais são consideradas negativas se derem uma reacção correspondente a menos de 10% da obtida com uma diluição de 1/200 do segundo soro padrão internacional de brucelose numa solução salina, ou qualquer outra diluição reconhecida, de acordo com o procedimento previsto comunitariamente. Os padrões para a prova Elisa de brucelose serão os especificados na parte A, n.os 1 e 2, do presente anexo (a utilizar nas diluições indicadas no rótulo).
3 - Condições de utilização da prova Elisa para a pesquisa da brucelose bovina - o método Elisa pode ser utilizado numa amostra de leite ou soro retirada de uma colheita de leite proveniente de uma exploração com, pelo menos, 30% de vacas leiteiras em lactação.
Se se utilizar este método, devem ser tomadas medidas que garantam a possibilidade de identificar, a partir da amostra, os animais de que provêm o leite ou os soros examinados.
ANEXO D
CAPÍTULO I
Efectivos, Estados membros e regiões oficialmente indemnes de leucose bovina enzoótica
A - Um efectivo é considerado oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica se:
i) Não existirem provas, quer clínicas quer laboratoriais, de qualquer caso de leucose bovina enzoótica no efectivo nem tiver sido confirmado qualquer caso nos dois anos anteriores; e
ii) Todos os animais com idade superior a 24 meses tiverem sido submetidos, com reacções negativas, a duas provas realizadas nos 12 meses precedentes, em conformidade com o presente anexo, com um intervalo de, pelo menos, quatro meses; ou
iii) Preencher as condições da alínea i) anterior e estiver situado numa região oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica.
B - Um efectivo manterá o estatuto de oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica se:
i) Continuar a estar preenchida a condição da alínea i) da parte A;
ii) Todos os animais introduzidos no efectivo forem provenientes de um efectivo oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica;
iii) Todos os animais com idade superior a 24 meses continuarem a apresentar reacção negativa a provas realizadas de três em três anos de acordo com o capítulo II.
C - O estatuto de efectivo oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica será suspenso caso deixem de estar preenchidas as condições especificadas na parte B anterior.
D - O estatuto permanecerá suspenso até que estejam preenchidas as seguintes condições:
1) Se, num efectivo oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica, apenas um animal tiver apresentado reacção positiva a uma das provas referidas no capítulo II:
i) O animal que reagiu positivamente e, no caso de uma vaca, todos os vitelos seus descendentes, devem ter sido retirados do efectivo e enviados para o matadouro, sob o controlo das autoridades veterinárias;
ii) Os restantes animais devem ter apresentado reacção negativa a provas sorológicas realizadas de acordo com o capítulo II, pelo menos três meses após a retirada dos animais positivos e dos seus eventuais descendentes;
iii) Deve ser realizado um inquérito epidemiológico, e os efectivos epidemiologicamente ligados ao efectivo infectado devem ser submetidos às medidas referidas na alínea ii).
A autoridade competente pode, no entanto, conceder uma derrogação da obrigação de abate do vitelo de uma vaca infectada, desde que este tenha sido separado da mãe após o parto. Neste caso, o vitelo deve ser submetido às condições previstas na alínea iii) do n.º 2);
2) Caso mais de um animal do efectivo oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica tenha apresentado reacção positiva ou caso tenha sido confirmada a infecção no efectivo:
i) Os animais que apresentaram uma reacção positiva e os respectivos vitelos, se se tratar de vacas, devem ser retirados para abate sob controlo das autoridades veterinárias;
ii) Todos os animais com idade superior a 24 meses devem ter sido submetidos, com reacção negativa, a duas provas realizadas de acordo com o capítulo II, com um intervalo mínimo de 4 e máximo de 12 meses;
iii) Todos os restantes animais devem, depois de identificados, permanecer no efectivo até terem idade superior a 24 meses e terem sido submetidos, com resultados satisfatórios, às provas referidas na alínea ii);
iv) Deve ser realizado um inquérito epidemiológico, devendo o efectivo epidemiologicamente ligado ao efectivo infectado ser submetido às medidas estabelecidas na alínea ii).
A autoridade competente pode, no entanto, conceder uma derrogação da obrigação de abate do vitelo de uma vaca infectada, desde que este tenha sido separado da mãe após o parto. Neste caso, o vitelo deve ser submetido às condições previstas na alínea iii);
3) Caso o estatuto de efectivo indemne de leucose bovina enzoótica tenha sido suspenso por qualquer outra razão, todos os animais do efectivo com idade superior a 24 meses devem apresentar reacção negativa a uma prova sorológica realizada de acordo com o capítulo II.
E - De acordo com o procedimento comunitariamente previsto pode ser proposta a concessão do estatuto de indemne de leucose bovina enzoótica ao território nacional ou região, se:
a) Pelo menos 99,8% do efectivo bovino estiverem indemnes de leucose bovina enzoótica, na acepção da parte A; ou
b) Não tiver sido confirmado qualquer caso de leucose bovina enzoótica no território nacional ou região, durante os últimos três anos, e, no caso da totalidade do território nacional, todos os animais com idade superior a 24 meses, de pelo menos 10% dos efectivos seleccionados ao acaso, tiverem sido submetidos, com resultados negativos, a uma prova nos termos do capítulo II nos 24 meses anteriores ou, no caso de uma região ou do território nacional, todos os animais com idade superior a 24 meses tiverem sido submetidos, com resultados negativos, a uma prova prevista no capítulo II.
F - O território nacional ou uma região manterão o estatuto de oficialmente indemnes de leucose bovina enzoótica se:
i) Se verificar anualmente, com base numa amostra ao acaso correspondente a um nível de confiança de 99%, que menos de 0,2% dos efectivos estão infectados, ou que pelo menos 20% dos bovinos com idade superior a 2 anos foram submetidos, com resultados negativos, a uma prova realizada de acordo com o capítulo II; ou
ii) Se não se tiver registado nenhum caso de leucose bovina enzoótica no território nacional ou região, numa proporção de 1 efectivo para 10000, durante pelo menos três anos; nesse caso, pode ser tornada, de acordo com o comunitariamente previsto, a decisão de interromper a pesquisa sorológica sistemática, desde que:
Todos os bovinos abatidos no território nacional ou região sejam submetidos a um exame post mortem por um veterinário oficial, que deverá notificar todos os tumores com vista a um exame laboratorial; e
Seja relatada a ocorrência de todos os casos de leucose bovina enzoótica na região afectada. De acordo com o procedimento comunitariamente previsto, pode ser proposta a suspensão ou revogação da decisão de interromper a pesquisa sorológica sistemática; e
Todos os bovinos com reacção positiva a uma prova de imunodifusão sejam abatidos, devendo o efectivo permanecer submetido a restrições até ao restabelecimento do seu estatuto nos termos do capítulo I, parte D, do presente anexo.
G - i) O estatuto de uma região oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica será suspenso, de acordo com o procedimento previsto comunitariamente, caso seja detectada e confirmada a presença de leucose bovina enzoótica em mais de 0,2% das explorações dessa região.
ii) O estatuto de oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica pode ser restabelecido de acordo com o procedimento previsto comunitariamente, se:
a) Para além das medidas previstas nos n.os 1 e 2 da parte D, pelo menos 20% dos outros efectivos seleccionados ao acaso na região ou no território nacional tiverem sido submetidos, dentro de um prazo de 12 meses, a uma das provas referidas no capítulo II;
b) Os resultados destas provas indicarem, com um nível de confiança de 99%, que menos de 0,2% dos efectivos estão infectados.
A pesquisa de leucose bovina enzoótica efectua-se mediante a prova de imunodifusão nas condições descritas nas partes A e B, ou mediante a prova de imunoabsorção enzimática (Elisa) nas condições descritas na parte C. O método de imunodifusão só se aplica às provas individuais. No caso de os resultados das provas serem objecto de uma contestação devidamente fundamentada, efectuar-se-á uma prova de imunodifusão como controlo complementar.
A - Provas de imunodifusão sobre placas de ágar para pesquisa de leucose bovina enzoótica:
1 - O antigénio a utilizar nesta prova deve conter glicoproteínas do vírus da leucose bovina. O antigénio deve ser padronizado em relação a um soro padrão (soro E1) fornecido pelo Statens Veterinaere Serumlaboratorium de Copenhaga.
2 - O organismo público encarregue de calibrar o antigénio padrão de trabalho no laboratório por comparação com o soro padrão oficial CEE (soro E1) fornecido pelo Statens Veterinaere Serumlaboratorium de Copenhaga é o Laboratório Nacional de Investigação Veterinária.
3 - Os antigénios padrão utilizados no laboratório devem ser apresentados pelo menos uma vez por ano aos laboratórios de referência CEE enumerados no n.º 2, para aí serem testados por comparação com o soro padrão CEE. Independentemente desta padronização, o antigénio utilizado pode ser calibrado nos termos da parte B.
4 - Na prova serão utilizados os reagentes seguintes:
a) Antigénio: o antigénio deve conter glicoproteínas específicas do vírus da leucose bovina enzoótica padronizado por comparação com o soro padrão oficial CEE;
b) O soro a testar;
c) Um soro de controlo positivo conhecido;
d) Ágar:
0,8% ágar;
8,5% NaCl;
Tampão Tris 0,05 M, pH 7,2;
devem colocar-se 15 ml deste ágar numa placa de Petri de 85 mm de diâmetro, o que dá uma altura de 2,6 mm de ágar.
5 - Preparar um dispositivo experimental de sete cavidades isentas de humidade por perfuração do ágar até ao fundo da placa; a rede assim obtida deverá ser constituída por uma cavidade central em torno da qual se ordenam seis cavidades periféricas dispostas em círculo.
Diâmetro da cavidade central: 4 mm;
Diâmetro das cavidades periféricas: 6 mm;
Distância entre a cavidade central e as cavidades periféricas: 3 mm.
6 - Encher a cavidade central com o antigénio padrão. As cavidades periféricas 1 e 4 (ver esquema abaixo) são enchidas com o soro positivo conhecido e as cavidades 2, 3, 5 e 6 com os soros a testar. As cavidades devem ser enchidas até ao desaparecimento do menisco.
7 - As quantidades obtidas são as seguintes:
Antigénio: 32 (mi)l;
Soro de controlo: 73 (mi)l;
Soro a testar: 73 (mi)l.
8 - A incubação deve durar setenta e duas horas à temperatura ambiente (20ºC-27ºC) em atmosfera húmida e fechada.
9 - A prova pode ser lida passadas vinte e quatro horas e passadas quarenta e oito horas, mas não se pode obter qualquer resultado final antes de passarem setenta e duas horas.
a) Um soro a testar é positivo se formar uma curva de precipitação específica com o antigénio do vírus da leucose bovina e se essa curva coincidir com a do soro de controlo.
b) Um soro a testar é negativo se não formar uma curva de precipitação específica com o antigénio do vírus da leucose bovina e se não inflectir a curva do soro de controlo.
c) A reacção não pode ser considerada concludente se:
i) Inflectir a curva do soro de controlo para a cavidade do antigénio do vírus da leucose bovina sem formar uma curva de precipitação visível com o antigénio; ou
ii) Não for possível interpretá-la como negativa ou como positiva.
No caso de as reacções não serem concludentes, pode repetir-se a prova e utilizar soro concentrado.
10 - Pode ser utilizada qualquer outra configuração ou distribuição das cavidades, desde que permita detectar como positiva uma diluição do soro E4 em soro negativo a 1:10.
B - Método de padronização do antigénio. - Soluções e materiais necessários:
1) 40 ml de ágar a 1,6% num tampão Tris 0,05 M/HCIl, pH 7,2, com 8,5% de NACl;
2) 15 ml de um soro de leucose bovina que só tenha anticorpos em relação às glicoproteínas do vírus da leucose bovina, diluído a 1:10 num tampão Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2, com 8,5% de NaCl;
3) 15 ml de um soro de leucose bovina que só tenha anticorpos em relação às glicoproteínas do vírus da leucose bovina, diluído a 1:15 num tampão Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2, com 8,5% de NaCl;
4) Quatro placas de Petri de plástico, com 85 mm de diâmetro;
5) Punção com 4 mm a 6 mm de diâmetro;
6) Antigénio de referência;
7) Antigénio a padronizar;
8) Banho-maria (56ºC).
Modo de execução:
Dissolver o ágar (1,6%) no tampão Tris/HCl, aquecendo com cuidado até 100ºC. Pôr no banho-maria a 56ºC durante cerca de uma hora. Colocar também as diluições do soro de leucose bovina no banho-maria a 56ºC.
Misturar em seguida 15 ml de solução de agarose a 56ºC com os 15 ml de soro de leucose bovina (1:10), agitar rapidamente e deitar em duas placas de Petri, à razão de 15 ml por placa.
Repetir as operações atrás descritas com o soro de leucose bovina diluído a 1:5.
Quando a agarose tiver endurecido, fazer as cavidades do seguinte modo:
Adição de antigénio:
i) Placas de Petri n.os 1 e 3:
Cavidade A - antigénio de referência não diluído;
Cavidade B - antigénio de referência diluído a 1:2;
Cavidades C e E - antigénio de referência;
Cavidade D - antigénio a testar, não diluído;
ii) Placas de Petri n.os 2 e 4:
Cavidade A - antigénio a testar, não diluído;
Cavidade B - antigénio a testar, diluído a 1:2;
Cavidade C - antigénio a testar, diluído a 1:4;
Cavidade D - antigénio a testar, diluído a 1:8.
Instruções complementares:
1 - A prova deve ser efectuada com dois graus de diluição do soro (1:5 e 1:10) a fim de obter a precipitação óptima.
2 - Se o diâmetro de precipitação for muito pequeno para cada um dos dois graus de diluição, deve fazer-se uma diluição suplementar do soro.
3 - Se o diâmetro de precipitação for excessivo para ambos os graus de diluição e se o precipitado for ténue, deve-se escolher um grau de diluição mais fraco para o soro.
4 - A concentração final de ágar deve ser de 0,8% e a dos soros de 5% e de 10%, respectivamente.
5 - Anotar os diâmetros medidos no gráfico seguinte. A diluição de trabalho é aquela em que se registar o mesmo diâmetro para o antigénio a testar e para o antigénio de referência.
C - Prova de imunoabsorção enzimática (Elisa) para a pesquisa de leucose bovina enzoótica:
1 - São os seguintes os materiais e reagentes a utilizar:
a) Microplacas para fase sólida, tinas ou qualquer outra fase sólida;
b) Antigénio fixado à fase sólida com ou sem a ajuda de anticorpos de captação policlonal ou monoclonal. No caso da LBE, se o antigénio for directamente aplicado à fase sólida, todas as amostras que apresentem reacções positivas devem ser testadas de novo em relação ao antigénio de controlo. Este deve ser idêntico ao antigénio testado, excepto no que respeita aos antigénios BLV. Se os anticorpos de captação forem aplicados à fase sólida, os anticorpos devem reagir apenas aos antigénios BLV;
c) Fluido biológico a examinar;
d) Controlos positivos e negativos correspondentes;
e) Conjugado;
f) Substrato adaptado ao enzima utilizado;
g) Solução de paragem, se necessário;
h) Soluções para a diluição das amostras de ensaio, para a preparação dos reagentes e para a lavagem;
i) Sistema de leitura adequado ao substrato utilizado.
2 - Normalização e sensibilidade do teste. - A sensibilidade da prova Elisa utilizada deve ser de um nível tal que o soro E4 seja positivo quando diluído 10 vezes (amostras de soro) ou 250 vezes (amostras de leite) em mais de uma solução obtida a partir de amostras colocadas em conjunto. Em provas em que as amostras (soro e leite) sejam examinadas individualmente, o soro E4, diluído à razão de 1:10 (para o soro negativo) ou à razão de 1:250 (para o leite negativo), deve dar uma reacção positiva quando for examinado na mesma diluição que é utilizada para os ensaios individuais. Os organismos públicos indicados no n.º 2 da parte A serão responsáveis pelo controlo da qualidade do método Elisa, nomeadamente para determinar, para cada lote de produção, o número de amostras a reunir, com base na contagem obtida com o soro E4.
O soro E4 é fornecido pelo Statens Veterinaere Serumlaboratorium de Copenhaga.
3 - Condições de utilização do teste Elisa para a pesquisa de leucose bovina enzoótica. - O método Elisa pode ser utilizado numa amostra de leite ou soro retirada de uma colheita de leite proveniente de uma exploração com pelo menos 30% das vacas leiteiras em lactação.
Se for utilizado este método, devem ser tomadas medidas que garantam a correspondência entre as amostras recolhidas e os animais de que provêm o leite ou os soros analisados.
ANEXO E (I)
a) Doenças dos bovinos:
Febre aftosa.
Raiva.
Tuberculose.
Brucelose.
Peripneumonia contagiosa dos bovinos.
Leucose bovina enzoótica.
Carbúnculo bacterídeo.
b) Doenças dos suínos:
Raiva.
Brucelose.
Peste suína clássica.
Peste suína africana.
Febre aftosa.
Doença vesiculosa do suíno.
Carbúnculo bacterídeo.
ANEXO E (II)
Doença de Aujeszky.
Rinotraqueíte infecciosa dos bovinos.
Infecção por Brucella suis.
Gastrenterite transmissível.
ANEXO F
Espécies bovina/suína de abate/de reprodução/de produção (ver nota 1)
Certificado n.: ...
Espécie: ...
Estado membro de origem: ...
Região de ...
Origem: ...
Nome e endereço do exportador: ...
Nome e endereço da exploração de origem: ... (ver nota 2)
Número de registo do comerciante: ... (ver nota 1)
Informações sanitárias:
Certifico que os animais adiante enumerados são originários de um efectivo ou de efectivos oficialmente indemnes de tuberculose, brucelose e leucose e que (ver nota 3):
O efectivo de origem se encontra num Estado membro ou numa parte do território de um Estado membro que é reconhecido como ou:
1) Oficialmente indemne de tuberculose: sim/não.
Decisão .../.../... da Comissão (ver nota 1);
2) Oficialmente indemne de brucelose: sim/não.
Decisão .../.../... da Comissão (ver nota 1);
3) Oficialmente indemne de leucose: sim/não.
Decisão .../.../... da Comissão (ver nota 1).
O Estado membro ou parte do território de um Estado membro aplica um sistema de redes de vigilância:
Decisão .../.../... da Comissão (ver nota 1).
Os animais adiante enumerados foram sujeitos às seguintes provas, com resultados negativos nos 30 dias que precederam a saída da exploração nos termos do n.º 2 do artigo 6.º do anexo A do regulamento anexo ao Decreto-Lei n.º .../..., de ... de ..., do seguinte modo:
Data da prova: ...
Prova de tuberculina (animais com mais de 6 semanas): sim/não.
Exigida ... (ver nota 1).
Prova de seroaglutinação brucélica (com exclusão dos animais castrados ou com menos de 12 meses): sim/não.
Exigida ... (ver nota 1).
Prova para pesquisa da leucose (animais com mais de 12 meses): sim/não.
Exigida ... (ver nota 1).
São animais para abate (ver nota 1).
São animais para abate originários de efectivos não oficialmente indemnes de tuberculose, brucelose e leucose e provêm de uma exploração situada em Espanha (ver nota 1) (ver nota 4); os animais adiante enumerados foram sujeitos a provas, com resultados negativos, nos 30 dias que precederam a saída da exploração de origem, do seguinte modo:
Data da prova: ...
Prova de tuberculina: ... (ver nota 1).
Prova de seroaglutinação brucélica: ... (ver nota 1).
Prova para pesquisa da leucose: ... (ver nota 1).
Identificação do animal: ...
Número total de animais: ...
Raça: ...
Tipo: ...
Idade: ...
Identificação oficial: ...
Data de partida: ...
Certificação relativa às secções A e B
(Carimbo oficial.)
Assinatura do veterinário oficial da exploração de origem ou, no caso de um Estado membro que tenha criado um sistema de rede de vigilância, assinatura do veterinário autorizado da exploração de origem (ver nota 1): ...
Nome (em maiúsculas): ...
Data: ...
Centro de agrupamento autorizado (ver nota 1):
Nome do centro: ...
Endereço: ...
Número de registo: ...
Data de chegada: ...
Data de partida: ...
Assinatura/carimbo: ...
Destino dos animais: ...
Nome e endereço do exportador: ...
Nome e endereço da exploração de destino: ... (ver nota 1).
Nome e endereço do centro de trânsito: ... (ver nota 1).
Meio de transporte: ...
Número de autorização: ...
Após verificação regulamentar, certifico que:
1 - Em ... (data) os animais em causa foram inspeccionados, nas vinte e quatro horas que precederam a partida, e não revelaram quaisquer indícios clínicos de doença infecciosa ou contagiosa.
2 - Se encontram satisfeitas todas as disposições aplicáveis do regulamento anexo ao Decreto-Lei n.º .../..., de ... de ...
3 - O transporte proposto foi registado no sistema ANIMO no dia da expedição.
4 - O animal/os animais a seguir indicado(s) satisfaz(em) as garantias suplementares relativas à ... (doença) dos ... (espécie/tipo) com destino a ... (Decisão .../.../.../CE da Comissão).
(Carimbo oficial.)
Assinatura do veterinário oficial: ...
Nome (maiúsculas): ...
Título: ...
Endereço: ...
O presente certificado é válido durante 10 dias a contar da data do exame sanitário referido na secção D acima.
(nota 1) Riscar as menções inúteis.
(nota 2) Não se aplica quando os animais são originários de várias explorações.
(nota 3) Não se aplica em caso de derrogação concedida a Espanha para animais para abate.
(nota 4) Sujeito ao acordo do país de destino.